康芮 劉春暉 陳思文 趙仁亮 周瓊瓊

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，鄭州 450000）

茶 樹（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze） 起 源于我國西南地區(qū)，喜溫喜濕，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在助力脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略中發(fā)揮著重要作用。近年來，由于全球氣候不穩(wěn)定性的增加，茶樹在其生長周期內(nèi)經(jīng)常遭遇低溫、干旱等逆境的危害，造成茶葉品質(zhì)與產(chǎn)量嚴(yán)重下降，嚴(yán)重時甚至?xí)?dǎo)致茶樹死亡，給茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］，因此，如何提高茶樹的抗逆性以抵御逆境傷害是育種工作者所關(guān)注的重點(diǎn)問題。

植物體內(nèi)鈣離子（Ca2+）作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，廣泛參與到植物的生長發(fā)育和外界刺激引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)植物受到刺激（包括激素處理、生物和非生物脅迫等）時，會引起細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度的瞬時變化，從而產(chǎn)生鈣信號并通過鈣靶蛋白進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，將信息傳遞到下游響應(yīng)蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)相應(yīng)的生理生化反應(yīng)過程，最終使植物響應(yīng)外界脅迫［3-4］。其中，鈣靶蛋白對鈣信號瞬時變化的感知和解碼是鈣信號傳遞途徑中最關(guān)鍵的調(diào)控步驟。植物細(xì)胞內(nèi)主要存在3種類型的鈣靶蛋白：鈣調(diào)蛋白/類鈣調(diào)蛋白（calmodulins/CaMs，CaM-like proteins/CMLs）、鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白（calcineurin B-like proteins，CBLs）和鈣依賴蛋白激酶（calciumdependent protein kinases，CDPKs/CPKs）［5-7］，這三大類鈣靶蛋白介導(dǎo)的鈣信號系統(tǒng)在植物應(yīng)對生長發(fā)育、生物及非生物逆境中起著重要作用。

CMLs是植物特有的一類鈣靶蛋白，含有1-6個鈣離子結(jié)合的EF-hand結(jié)構(gòu)域，是植物特有的一類鈣靶蛋白。CMLs的功能僅有少數(shù)植物被研究，大部分家族成員的分子調(diào)控和生物功能仍未知，但它們在植物的生長發(fā)育、病蟲害防御及外界條件刺激下發(fā)揮著重要作用［8-10］。據(jù)報(bào)道，擬南芥、水稻和番茄基因組中分別鑒別到50個［11］、32個［12］和52個［13］CML 基因，苜蓿中有 50 個 MtCMLs［14］。其中，擬南芥 AtCML8、AtCML24、AtCML37、AtCML38和AtCML39在非生物脅迫和ABA等刺激下表達(dá)量均顯著提高［15-17］；AtCML42 在抵御昆蟲時起重要作用［18］。水 稻 體 內(nèi) 的 CML 基 因 OsMSR2（OsCML24）［19］、OsCML4［20］、OsDSR-1［21］和 OsCML16［22］受非生物脅迫（如低溫、干旱和鹽等）誘導(dǎo)。除了擬南芥和水稻，野 生 番 茄 ShCML44［23］、 杜 仲 EuCML5［24］、 蘋 果MdCML3［25］、葡萄 VaCML21［26］等均在非生物脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)。杜昱林［27］以茶樹花粉為材料低溫處理篩選到CsCML21。茶樹逆境生理與分子生物學(xué)課題組前期以龍井長葉為材料克隆了5個茶樹CML基因，分析了其組織表達(dá)特異性，并進(jìn)行了低溫、干旱、鹽脅迫和ABA處理，結(jié)果顯示，CML基因均有不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)［28］。由此看來，CMLs的轉(zhuǎn)錄活性受到外界刺激的影響。

CML蛋白在植物抵抗低溫、干旱、高鹽和激素處理等外界刺激過程中發(fā)揮重要作用，是抗性分子育種的重要信號蛋白。然而，目前CML24的報(bào)道較少，其功能及其脅迫響應(yīng)機(jī)制尚不清晰。

本研究以龍井43茶樹品種為材料，克隆獲得CsCML24，并對該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行序列比對、理化性質(zhì)和進(jìn)化樹分析等。通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)研究該基因在低溫、干旱、鹽脅迫和ABA處理下的響應(yīng)模式，為進(jìn)一步研究茶樹CsCML24對逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以龍井43一年生扦插苗作為試驗(yàn)材料，選取長勢一致的扦插苗置于光周期16 h/8 h、光照強(qiáng)度為240 μmol/（m2·s）、晝夜溫度設(shè)置為 25℃/22℃、相對濕度為75%-80%的人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，一周后進(jìn)行不同組織部位取樣和逆境脅迫處理。

組織特異性分析：選取茶樹植株的不同組織（包括根、莖、嫩葉、成熟葉和花），立即用液氮速凍并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；逆境脅迫處理：以未處理的植株作為對照（CK），進(jìn)行低溫（10℃）、干旱（20%PEG 6000）、高鹽（200 mmol/L NaCl）和ABA（100 μmol/L）處理，分別在脅迫處理后0、2、4、8、12和24 h取樣（取第3片葉），每個時間設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 茶樹總RNA提取及cDNA合成 利用RNA-prep Pure Plant Kit植物多糖多酚試劑盒（天根生化科技有限公司）提取茶樹總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，合格的RNA樣品于-80℃保存。以檢測合格的RNA為模板，使用 HiScript? III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）完成基因組DNA的去除和cDNA第一鏈的合成。

1.2.2 茶樹CsCML24的克隆 使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CsCML24的CDS區(qū)全長引物，序列為CsCML24-F和CsCML24-R（表1）。以獲得的cDNA為模板，使用高保真酶Primer STAR? HS DNA Polymers進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?98℃ 3 min ；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃ 7 min。使用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，將目的條帶切膠回收、純化。將純化的產(chǎn)物與pClone007 Simple Vector克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.3 茶樹CsCML24的生物信息學(xué)分析 利用NCBI網(wǎng)站（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov /Blast.cgi）進(jìn)行BLAST和蛋白保守域的預(yù)測。利用在線工具包ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）對CsCML24編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析。利用在 線 軟 件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。在PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/form2.html）網(wǎng)站上預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。利用Prabi-gerland（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）和Swiss-model軟件來預(yù)測分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。使用DNAMAN9.0軟件進(jìn)行CsCML24氨基酸多序列比對。利用MEGA7.0軟件MEGE-X鄰近歸并法（neighbor-joining method）構(gòu)建茶樹CsCML24與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 茶樹CsCML24的表達(dá)特性分析 使用Premier 5.0軟件在CsCML24的CDS區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)定量引物，定量引物序列為CsCML24qRT-F和CsCML24qRT-R（表1）。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋到200 ng/μL后作為模板，以CsPTB作為內(nèi)參基因（GenBank登錄號為GAAC01052498.1），進(jìn)行熒光定量分析。參照Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書（諾唯贊，南京）進(jìn)行操作，利用Applied Biosystems 7500FAST熒光定量儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，分析CsCML24在茶樹不同組織中的表達(dá)模式，以及受到低溫、ABA、高鹽和干旱非生物脅迫后的相對表達(dá)量變化。采用2-△△CT法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 茶樹CsCML24的克隆及序列分析

以龍井43cDNA為模板，利用特異性引物CsCML24-F和CsCML24-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，克隆得到CsCML24（GenBank登錄號為MZ325391）。經(jīng)測序，該基因CDS長度為480 bp，預(yù)測可編碼159個氨基酸（圖1）。

圖1 CsCML24的克隆Fig. 1 Cloning of CsCML24 gene

2.2 CsCML24編碼蛋白理化性質(zhì)分析

應(yīng)用在線軟件對該蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，預(yù)測該蛋白質(zhì)的分子式為C1386H2294N480O593S96，原子總數(shù)為4 849，分子量為38 248.08 Da，理論等電點(diǎn)為5.23，由159個氨基酸組成，不穩(wěn)定系數(shù)為38.05，脂肪系數(shù)為22.08（表2）。用DNAMAN9.0軟件對蛋白進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果（圖2）顯示，該蛋白疏水性最高的位點(diǎn)在第155位氨基酸為1.456，親水性最高的位點(diǎn)在第85位氨基酸為-1.889，總平均值為負(fù)值（Gravy）-0.596，屬于穩(wěn)定的親水性蛋白。CsCML24為非跨膜蛋白，SignalP-HMM在線預(yù)測CsCML24不具有信號肽，屬于非分泌蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，該蛋白可能位于細(xì)胞質(zhì)中。

表2 CsCML24蛋白的基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physicochemical properties of CsCML24 protein

圖2 茶樹CsCML24氨基酸序列親疏水性分析Fig. 2 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of amino acids in CsCML24 from C. sinensis

2.3 保守基序預(yù)測及蛋白結(jié)構(gòu)分析

CsCML24蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成，占49.06%，除此之外，還含有9.43%的β-轉(zhuǎn)角和6.92%的延伸片段，以及34.59%的無規(guī)則卷曲（圖3）。對CsCML24三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，其三維結(jié)構(gòu)推測與二級結(jié)構(gòu)基本吻合，其中，α-螺旋占蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的大部分區(qū)域，無規(guī)則卷曲和β-折疊分散其中（圖4）。對CsCML24進(jìn)行磷酸化結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)可能有12個，位于多肽 鏈 的 第 12、14、16、34、36、40、46、61、65、78、138和149位氨基酸，其中，14、34、46、61、65位氨基酸的預(yù)測值均在0.934以上，說明這些位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生磷酸化的可能性很高。絲氨酸可能的磷酸化位點(diǎn)有8個，蘇氨酸可能的磷酸化位點(diǎn)有4個（圖5）。

圖3 茶樹CsCML24二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 Secondary structure prediction of CsCML24 in C.sinensis

圖4 茶樹CsCML24三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 4 3-dimension structure prediction of CsCML24 in C.sinensis

圖5 茶樹CsCML24磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig. 5 Phosphorylation site prediction of CsCML24 in C.sinensis

2.4 CsCML24進(jìn)化樹分析和氨基酸序列比對

將CsCML24的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行同源性搜索和保守域預(yù)測，結(jié)果顯示該氨基酸屬于Ca2+結(jié)合蛋白，含有Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，屬于EF-hand超家族，在16-80氨基酸位點(diǎn)中間含有EF-hand特異結(jié)構(gòu)域（圖6）。多重序列比對結(jié)果顯示茶樹CsCML24與 獼 猴 桃（Actinidia rufa）、 陸 地 棉（Gossypium arboreum）、櫻桃（Prunus avium）等多個物種的CML具有較高相似性，相似性均在70%以上，且這些物種中的CML蛋白中均含有EF-hand結(jié)構(gòu)域和Ca2+結(jié)合位點(diǎn)（圖7）。通過構(gòu)建進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)茶樹CsCML24與獼猴桃、煙草等親緣關(guān)系較近，與桃、李子、櫻桃等薔薇科的植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，該系統(tǒng)進(jìn)化樹反映了CsCML24蛋白的進(jìn)化規(guī)律（圖8）。

圖6 茶樹CsCML24保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 6 Conserved domain prediction of CsCML24 in C. sinensis

圖7 CsCML24氨基酸序列與其他植物的多重序列比對Fig. 7 Multiple sequence alignment of amino acid sequences among CsCML24 and other plants

圖8 CsCML24與其他物種氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 8 Phylogenetic tree analysis of deduced amino acid sequences of CML24 from C. sinensis and other plant species

2.5 CsCML24組織表達(dá)模式分析

通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，分析CsCML24在茶樹的根、莖、嫩葉、成熟葉和花中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，CsCML24在成熟葉片中表達(dá)量最高，在根和花中的表達(dá)量次之，而在莖中表達(dá)量相對較低，說明CsCML24隨著茶樹的生長發(fā)育，在葉片中的表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢（圖9）。由此推測CsCML24在葉片的發(fā)育中起到重要作用，在茶樹的根和花中也有著一定的作用。

圖9 CsCML24在茶樹不同組織部位中的表達(dá)模式Fig. 9 Expression patterns of CsCML24 in various tissues of C. sinensis plant

2.6 CsCML24對非生物脅迫的響應(yīng)

茶樹CsCML24在4種脅迫下均能誘導(dǎo)表達(dá)，不同脅迫及不同處理時間下該基因的表達(dá)存在差異。在低溫處理下，CsCML24的相對表達(dá)量呈先升高后降低隨后又升高的趨勢，在處理4 h時其表達(dá)量達(dá)到最大值，為CK的5.68倍，在處理的8 h和12 h時，表達(dá)量也很高，分別為CK的5.37和3.76倍，24 h時表達(dá)量低于對照水平。在外源噴施ABA處理下，CsCML24表達(dá)量在2 h內(nèi)明顯增加，與對照組差異顯著，隨后下降，在4 h降至最低，隨后8、12和24 h后表達(dá)量與對照組相比顯著上升，分別為CK的2.25、1.98和1.91倍，表明CsCML24的表達(dá)受到ABA信號的誘導(dǎo)。鹽脅迫下CsCML24表達(dá)量在4 h時表達(dá)量顯著低于對照組，在8 h時達(dá)到最大，為CK的1.37倍，之后逐漸下降。在干旱脅迫下CsCML24表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，在2 h時出現(xiàn)顯著增長，4 h表達(dá)量降至最低，之后表達(dá)量又開始上升，在24 h后與對照相比表達(dá)量呈上升趨勢（圖10）。

圖10 CsCML24在不同脅迫條件下的表達(dá)情況Fig. 10 Expression analysis of CsCML24 gene under different stress treatments

3 討論

Ca2+是植物介導(dǎo)各種激素和環(huán)境信號的重要信使，廣泛參與到植物的生長發(fā)育以及逆境脅迫的調(diào)控之中。類鈣調(diào)蛋白作為一類重要的鈣感受器，在Ca2+信號通路中發(fā)揮重要作用。本研究從龍井43茶樹中克隆了CsCML24，該基因cDNA全長為480 bp，編碼159個氨基酸，該蛋白為親水性的非跨膜蛋白，含有EF-hand保守結(jié)構(gòu)域，序列分析顯示與其他植物的CML具有較高的相似性，表明不同物種的CML蛋白之間存在著較近的進(jìn)化關(guān)系。

CML具有組織特異性。張滿倉等［29］發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StCML主要在花、葉柄、芽和塊莖等中有特異表達(dá)。李迎迎等［30］在‘西伯利亞’百合中發(fā)現(xiàn)LiCML在花藥中表達(dá)量最高，而在根、莖、子房和花柱中的表達(dá)量極少。Ma等［28］在茶樹中克隆出CsCML16、CsCML18-1、CsCML18-2、CsCML38和 CsCML42五個CML基因，這些基因在茶樹的各個部位中也都有表達(dá)。本研究中CsCML24在茶樹不同組織部位中的表達(dá)水平差異較大，在成熟葉片中表達(dá)量最大，其次是根，而在莖中的表達(dá)量最低，說明基因的轉(zhuǎn)錄水平在不同組織中存在差異。

研究表明植物CML基因的表達(dá)受非生物脅迫的誘導(dǎo)。如AtCML24能夠在擬南芥中響應(yīng)高溫、低溫、氧脅迫及ABA的誘導(dǎo)中表達(dá)，參與到擬南芥的非生物脅迫響應(yīng)中［31］。OsCML16在低溫脅迫下表達(dá)量顯著提高，可能參與到水稻冷脅迫響應(yīng)中［22］。在番茄中，過表達(dá)SlCML44的番茄植株對寒冷、干旱和鹽脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，并且具有更高的發(fā)芽和更好的幼苗生長，SlCML16和SlCML51也在冷脅迫下被誘導(dǎo)，推測其可能也參與到番茄對冷脅迫的響應(yīng)中［23］。申清湄［32］對苜蓿低溫脅迫下MfCML24表達(dá)分析的研究結(jié)果顯示，MfCML24在低溫逆境表達(dá)量變化為“升-降-升”3個階段。在本研究中，低溫和干旱脅迫下CsCML24表達(dá)量均明顯上調(diào)，與申清湄的研究結(jié)果相似，說明CsCML24的表達(dá)受低溫和干旱脅迫的誘導(dǎo)，CsCML24可能參與植物響應(yīng)低溫、干旱脅迫的調(diào)控；在鹽脅迫下，CsCML24的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而且相較低溫、干旱和ABA處理下，該基因的表達(dá)量整體比較低，說明該基因?qū)}脅迫不敏感，不同物種的CML基因表達(dá)模式可能存在差異；CsCML24在ABA誘導(dǎo)的表達(dá)量呈上升-下降-上升的狀態(tài)，說明其在ABA依賴型調(diào)控途徑中可能起到重要作用。其中CsCML24在非生物脅迫處理下，2 h的時候表達(dá)量明顯增加，而在4 h表達(dá)量下降，之后又上升，這種變化可能與植物的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)［33-35］，猜測基因可能在植物應(yīng)對非生物脅迫中存在兩個調(diào)控途徑，在剛遭遇非生物脅迫時，植物感應(yīng)到各種外源信號的時候很敏感，引起植物的應(yīng)激反應(yīng)，從而引起相關(guān)基因的快速上調(diào)表達(dá)，之后植物開始緩慢適應(yīng)逆境環(huán)境，啟動另一種抗逆境脅迫途徑，來讓植株緩慢適應(yīng)環(huán)境，盡可能減少環(huán)境對植株的損傷，這與劉偉等的［24］研究結(jié)果相一致，杜仲EuCML5的表達(dá)量在鹽處理4 h時也是下降的。綜上，本研究通過克隆龍井43茶樹CsCML24并研究其在不同組織中的表達(dá)差異，及不同非生物脅迫處理下的表達(dá)模式，結(jié)果表明，CsCML24在多種脅迫下均有響應(yīng)，可能參與到多種植物對脅迫的調(diào)控作用，這為今后研究該基因功能及其逆境脅迫下的作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

克隆獲得一個類鈣調(diào)蛋白基因CsCML24，其含有典型的EF-hand保守結(jié)構(gòu)域，能與Ca2+結(jié)合發(fā)揮鈣調(diào)蛋白的功能。CsCML24在茶樹各組織中均表達(dá)，在成熟葉的表達(dá)量顯著高于其他組織，莖中表達(dá)量較低。低溫、干旱、高鹽和ABA均能誘導(dǎo)CsCML24的表達(dá)，且在不同脅迫下表達(dá)差異顯著，推測該基因可能在茶樹響應(yīng)和抵抗非生物脅迫的過程中發(fā)揮作用。