張斌 楊昕霞

（湖南科技學(xué)院 湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，永州 425199）

作為我國主要作物之一，水稻在糧食生產(chǎn)中占據(jù)著重要位置。但是，我國鹽堿地總面積達(dá)9 913萬hm2，約占全國土地面積的1/10［1］。鹽脅迫會(huì)使水稻受到滲透脅迫、離子毒害、氧化脅迫和營養(yǎng)脅迫，影響水稻生長發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致植株死亡［2-3］，因此，有關(guān)水稻耐鹽機(jī)制的研究備受關(guān)注。面對(duì)鹽脅迫，植物在分子水平、生理代謝和形態(tài)結(jié)構(gòu)上進(jìn)化出復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，如調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的表達(dá)來改善代謝水平和形態(tài)結(jié)構(gòu)［4］。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）通過激活或抑制靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，調(diào)控一系列的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在應(yīng)激反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用［5］。根據(jù)國家水稻數(shù)據(jù)中心網(wǎng)站（https://www.ricedata.cn）公布的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有大量功能基因和調(diào)節(jié)基因參與脅迫應(yīng)答，然而利用RNASeq分析響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)TF的報(bào)到卻很少。因此，本研究利用鹽脅迫下水稻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析與之相關(guān)的TF基因，通過蛋白互作篩選出重要模塊基因進(jìn)行功能富集分析鑒定出關(guān)鍵TF基因，并進(jìn)行qRTPCR驗(yàn)證，為后續(xù)進(jìn)行水稻遺傳改良提供了候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA530826/）下載。水稻種子為日本晴（Nipponbare）。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)基因的篩選 利用hisat2軟件建立索引以及比對(duì)到參考基因組，通過stringtie軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝、合并和定量，篩選出網(wǎng)站（http://planttfdb.gao-lab.org/）中所有TF基因所對(duì)應(yīng)的表達(dá)數(shù)據(jù)，通過DESeq2軟件進(jìn)行差異分析。以P值≤0.01且|log2foldChange|≥2為條件篩選鹽脅迫1 h（0 h vs 1 h）、3 h（0 h vs 3 h）和6 h（0 h vs 6 h）時(shí)間段的差異表達(dá)TF基因，利用ggplot2軟件繪制差異表達(dá)TF基因的樣品間PCA圖，樣品相關(guān)性熱圖、火山圖和韋恩圖。

1.2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、重要模塊篩選和關(guān)鍵TF鑒定 利用數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org），設(shè)置參數(shù)interaction score≥0.15，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；利用MCODE插件，篩選核心模塊；核心模塊中的差異表達(dá)TF基因?yàn)殛P(guān)鍵TF基因。

1.2.3 重要模塊中基因的富集分析 設(shè)置FDR值≤0.05，利用在線軟件（http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/）對(duì)重要模塊中的基因進(jìn)行GO富集分析；設(shè)置P值≤0.05，利用在線軟件（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/）對(duì)重要模塊中的基因進(jìn)行KEGG富集分析，利用ggplot2插件進(jìn)行繪圖。

1.2.4 qRT-PCR檢測基因表達(dá) 水稻種子發(fā)芽后培養(yǎng)14 d（28℃，14 h白天/10 h黑夜），將幼苗轉(zhuǎn)移到含200 mmol/L NaCl的1/10的MS培養(yǎng)基中，0 h、1 h、3 h和6 h采集莖葉組織，液氮中速凍，-80℃下保存。利用TRIzol法提取總RNA，添加Dnase I去除DNA污染，反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix（Thermo）合成 cDNA。利用ABI7500定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR檢測，2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性32 min；94℃變性 10 s，60℃退火 10 s，72℃延伸10 s，40 個(gè)循環(huán) ；總體系 20 μL ：10 μL SYBR Green Mix（Thermo），8 μL RNAase-free水，0.5 μL 引物，1.0 μL模板。Os10g0510000為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR反應(yīng)引物序列和基因注釋信息Table 1 Primer sequence for qRT-PCR and gene annotation information

2 結(jié)果

2.1 樣本關(guān)系分析

從圖1中可知，相同處理測序樣品間距離較近，不同處理及品種間樣品基因表達(dá)水平存在明顯差異，距離較遠(yuǎn)；根據(jù)重復(fù)性分析結(jié)果，相同處理樣品間測序樣品間重復(fù)性高，系統(tǒng)誤差較小，結(jié)果可信度高。

圖1 測序樣品關(guān)系Fig. 1 Relationship among sequencing samples

2.2 差異表達(dá)基因篩選

鹽脅迫1 h檢測到125個(gè)差異表達(dá)TF基因，85個(gè)上調(diào)，40個(gè)下調(diào)（圖2-A）；3 h檢測到162個(gè)，88個(gè)上調(diào)，74個(gè)下調(diào)（圖2-B）；6 h 檢測到172個(gè)，88個(gè)上調(diào)，84個(gè)下調(diào)（圖2-C）。鹽脅迫1、3和6 h共有26個(gè)相同差異表達(dá)TF基因（表2），分別有49個(gè)、75個(gè)和89個(gè)獨(dú)特差異表達(dá)TF基因（圖2-D）。

表2 26個(gè)相同差異表達(dá)TF基因在STRING中的注釋Table 2 Notes of 26 identical differentially expressed TF genes in STRING

圖2 鹽脅迫差異表達(dá)基因和相同差異表達(dá)基因篩選圖Fig. 2 Screening of differentially expressed genes(DEGs)and identifical DEGs under salt stress

2.3 基因互作網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵基因篩選

26個(gè)相同差異表達(dá)TF基因主要有：ERF、C2H2、MYB、NAC和HSF家族，其中ERF家族數(shù)量最多，占總數(shù)的26.9%（圖3-A）。利用在線數(shù)據(jù)庫分析26個(gè)差異表達(dá)TF的蛋白互作關(guān)系，篩選出含有14個(gè)基因的重要模塊（圖3-B）；在重要模塊中，有 6個(gè) HSP70、3個(gè) HSP90、5個(gè) HSF基 因， 其中Os03g0745000和Os06g0553100為關(guān)鍵TF基因（圖3-C）。

圖3 相同差異表達(dá)基因分類、重要模塊篩選和關(guān)鍵TF篩選圖Fig. 3 Classification of the identical differentially expressed genes，important module and key TF screening

2.4 重要模塊基因GO和KEGG富集分析

核心模塊中14個(gè)基因的GO分析顯示分子功能主要富集在ATP結(jié)合、細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞質(zhì)膜囊泡組分上和生物學(xué)過程主要富集在對(duì)脅迫的反應(yīng)上（圖4-A-C）。KEGG分析顯示14個(gè)基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和內(nèi)吞作用的通路上（圖4-D）。

圖4 重要模塊基因GO和KEGG富集圖Fig. 4 GO and KEGG enrichment map of important module genes

2.5 TF基因差異表達(dá)驗(yàn)證

為驗(yàn)證測序結(jié)果的可靠性，在水稻幼苗經(jīng)鹽脅迫處理1 h后，選取2個(gè)已報(bào)道鹽脅迫相關(guān)基因Os03g0322900和Os11g0454300進(jìn)行qRT-PCR檢測，驗(yàn)證鹽脅迫處理是否適當(dāng)；并對(duì)Os03g0745000和Os06g05531005兩個(gè)關(guān)鍵TF基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在鹽脅迫后Os03g0322900和Os11g0454300表達(dá)量顯著升高（圖5-A），表明模擬鹽旱脅迫處理適當(dāng)。Os06g0553100和Os03g0745000兩個(gè)關(guān)鍵TF基因表達(dá)上調(diào)與測序結(jié)果一致（圖5-B），進(jìn)一步說明了通過轉(zhuǎn)錄組鑒定水稻中響應(yīng)鹽脅迫關(guān)鍵TF基因的可靠性。

圖5 鹽脅迫相關(guān)基因表達(dá)驗(yàn)證Fig. 5 Expression verification of salt stress related genes

2.6 鹽脅迫不同時(shí)段相關(guān)基因的表達(dá)檢測

驗(yàn)證測序可靠后，檢測了重要模塊中4個(gè)基因在不同鹽脅迫時(shí)間點(diǎn)（0、1、3和6 h）的表達(dá)水平，相關(guān)注釋信息（表2）。從圖6可以看出，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長，兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和熱激蛋白的表達(dá)量都呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)模式。

圖6 鹽脅迫不同時(shí)段相關(guān)基因的表達(dá)檢測Fig. 6 Expression detection of related genes at different time points of salt stress

3 討論

TF通過激活或抑制靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。目前已鑒定與脅迫相關(guān)TF基因家族有NAC、MYB、WRKY、bZIP和ERF/DREB等［8］。本研究對(duì)水稻鹽脅迫1、3和6 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共有26個(gè)相同差異表達(dá)TF基因，主要為ERF、C2H2和HSF等家族基因，說明這些TF在參與響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮一定的功能。鹽脅迫可以引起蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和組裝，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中輸出錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)到溶酶體中降解的過程中，需要消耗ATP。研究結(jié)果顯示重要模塊中的14個(gè)基因GO分析主要富集在ATP結(jié)合、對(duì)脅迫的反應(yīng)和細(xì)胞質(zhì)膜囊泡組上；KEGG分析顯示主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和內(nèi)吞作用等途徑上。HSP70是蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)組件之一，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中具有重要作用［9］。HSP70的缺失賦予酵母鎘耐受性，與HSP101和sHSP共同作用促進(jìn)細(xì)胞毒性聚集物的去除［10］；可以通過影響HsfAs和HSP101的活性負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的耐熱性［11］；擬南芥過表達(dá)OsHSP增加了耐熱性和耐鹽性［12］。Leng等［13］認(rèn)為 HSP70參與擬南芥的發(fā)育調(diào)控和非生物脅迫反應(yīng)。本研究重要模塊中14個(gè)基因含有6個(gè)HSP70基因。熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcriptional factor，Hsf）通過調(diào)控一系列熱激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與生物與非生物脅迫的反應(yīng)過程。本研究鑒定Os03g0745000和Os06g0553100同屬Hsf基因。Os03g0745000受多種脅迫的誘導(dǎo)，與OsHsfB4b相互作用［14-16］；在熱激反應(yīng)中OsHsfB4b參與水稻細(xì)胞質(zhì)OsClpB基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［17］；同一家族成員OsHsfA2e在擬南芥中過度表達(dá)可以增強(qiáng)耐熱性和耐鹽性［18］。本研究表明，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長，兩個(gè)關(guān)鍵Hsf和兩個(gè)HSP70基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，因此，我們推測這兩個(gè)Hsf可能通過調(diào)控?zé)峒さ鞍谆虻霓D(zhuǎn)錄表達(dá)，影響蛋白質(zhì)折疊和組裝，從而在水稻響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用，但是需要進(jìn)一步研究來驗(yàn)證。

4 結(jié)論

水稻在鹽脅迫1 h、3 h和6 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有26個(gè)相同的差異表達(dá)TF；通過蛋白互作篩選出14個(gè)基因的核心模塊；GO分析14個(gè)基因顯著富集在ATP結(jié)合、對(duì)脅迫的反應(yīng)和細(xì)胞質(zhì)膜囊泡組上；KEGG分析顯著富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和內(nèi)吞作用途徑上。鑒定出Os03g0745000和Os06g0553100兩個(gè)關(guān)鍵Hsf，qRT-PCR檢測結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了其可靠性。