黃生祥，梅海波，赫榮國(guó)，劉 昆，唐 進(jìn)，伍海燕

兒童慢性骨髓炎是兒童骨科領(lǐng)域的常見病和多發(fā)病[1-2]，其導(dǎo)致的骨缺損發(fā)生率較高，如未能予以有效治療將造成骨骼畸形，對(duì)患兒的生長(zhǎng)和生活將造成不可挽回的損失與傷害[3-4]。目前，對(duì)于兒童骨髓炎導(dǎo)致的骨缺損缺少有效的治療方案，大多依靠患兒自身的愈合能力和藥物，但療效不佳[5-6]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有多向分化潛能，可以分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等人體細(xì)胞，而且BMSCs來(lái)源于患者自體，移植后可避免機(jī)體的排斥反應(yīng)。但是干細(xì)胞具有易老化、分化方向不定和傳代少的缺點(diǎn)[7-8]。本研究利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)的過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，探討其促成骨分化的作用，旨在為兒童骨髓炎骨缺損的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料胎牛血清購(gòu)自BI公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；2.5 g/L胰蛋白酶、茜素紅染液、堿性磷酸酶(ALP)染液等均購(gòu)自北京碧云天生物有限公司。

1.2 BMSCs的獲取和培養(yǎng)利用無(wú)菌骨穿針從10例健康志愿者的髂骨中取新鮮骨髓組織，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行稀釋，然后加入0.01 mol/L的胎牛血清，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，采用差速培養(yǎng)法進(jìn)行BMSCs的培養(yǎng)。本研究已獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 BMSCs的鑒定采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs中CD33、CD45、CD90、CD106等表面蛋白的表達(dá)，并檢測(cè)其表達(dá)含量。

1.4 BMP-7過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建利用PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中GENE Bank查詢BMP-7的編碼基因內(nèi)含子序列，以XhoI/BamHI為切入點(diǎn)設(shè)計(jì)單鏈mRNA序列，構(gòu)建BMP-7的過(guò)表達(dá)載體。慢病毒的包被需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，獲得高滴度慢病毒。將P2代BMSCs同質(zhì)化處理后，根據(jù)感染復(fù)數(shù)(MOI)值轉(zhuǎn)染慢病毒，然后利用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。

1.5 BMSCs的分組根據(jù)BMSCs是否轉(zhuǎn)染BMP-7過(guò)表達(dá)載體分為轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組(作為對(duì)照)。

1.6 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染14 d后收集細(xì)胞，加入1 ml的Trizol試劑，提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將單鏈RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，4 ℃保存，RT-PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)RNA水平。引物序列如下：BMP-7：正義鏈5′-AGATTCTAAAGGTGCGTTGCTGCC-3′,反義鏈5′-TCTATTAACTGTAATCCTCCTCTGG-3′；ALP：正義鏈5′-TTATGCGTAAGTT CCGGTAATGCCC-3′，反義鏈 5′-AATTCCGTGTGTACGTGCTGCTGAC-3′；Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)：正義鏈5′-TTAAGTGCTCTCG-ACGTCGCACTGCT-3′，反義鏈5′-AATTGCTGCTAG-CTGACGTACGTACG-3′；骨鈣素(OCN)：正義鏈5′-TTCGTGTGTGTGCACACATGACACAA-3′，反義鏈5′-TTGTGTGTGCACACAGTGTAAATGTCA-3′；3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：正義鏈5′-GCGTGTACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反義鏈5′-TGGTTTGCCTAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.7 茜素紅染色慢病毒轉(zhuǎn)染14 d后收集細(xì)胞，接種于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定后按照茜素紅染色試劑盒說(shuō)明書要求，將茜素紅染液加入6孔板中進(jìn)行孵育，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.8 ALP染色慢病毒轉(zhuǎn)染14 d后收集細(xì)胞，接種于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定后按照ALP染色試劑盒說(shuō)明書要求，將ALP染液加入6孔板中進(jìn)行孵育，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)結(jié)果和表達(dá)含量見圖1。CD90和CD106的表達(dá)為60.2%和58.3%；CD33和CD45的表達(dá)為3.4%和2.6%。

圖1 BMSCs的培養(yǎng)和表達(dá)(×200) A.原代BMSCs；B.第2代BMSCs；C.第2代BMSCs表面蛋白CD90的表達(dá)為60.2%；D.第2代BMSCs表面蛋白CD106的表達(dá)為58.3%；E.第2代BMSCs表面蛋白CD33的表達(dá)為3.4%；F.第2代BMSCs表面蛋白CD45的表達(dá)為2.6%

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖2。慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染滴度為3×108TU/ml。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染結(jié)果(×200) A.熒光下視野；B.白光下視野

2.3 BMP-7以及成骨分化標(biāo)志物ALP、Runx2和OCN的mRNA的相對(duì)表達(dá)量見圖3。BMP-7以及成骨分化標(biāo)志物ALP、Runx2和OCN的mRNA的相對(duì)表達(dá)量轉(zhuǎn)染組均明顯高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。

圖3 BMP-7以及成骨分化標(biāo)志物ALP、Runx2和OCN的mRNA的相對(duì)表達(dá)量 與未轉(zhuǎn)染組比較：*P<0.05

2.4 茜素紅染色結(jié)果見圖4。轉(zhuǎn)染組肉眼可見明顯的紅色染色區(qū)域，鏡下可見大量鈣結(jié)節(jié)點(diǎn)。

圖4 茜素紅染色 A.未轉(zhuǎn)染組肉眼視野；B.未轉(zhuǎn)染組鏡下視野(×200)；C.轉(zhuǎn)染組肉眼視野；D.轉(zhuǎn)染組鏡下視野(×200) 圖5 ALP染色 A.未轉(zhuǎn)染組肉眼視野；B.未轉(zhuǎn)染組鏡下視野(×200)；C.轉(zhuǎn)染組肉眼視野；D.轉(zhuǎn)染組鏡下視野(×200)

2.5 ALP染色結(jié)果見圖5。轉(zhuǎn)染組肉眼可見紫色染色區(qū)域，鏡下可見ALP染色呈強(qiáng)陽(yáng)性。

3 討論

兒童骨髓炎導(dǎo)致的骨缺損在臨床上較常見，骨髓炎所致骨壞死、骨溶解、骨吸收以及局部的清創(chuàng)手術(shù)均可造成脛骨不連接，合并大段骨缺損和肢體短縮畸形，其臨床治療具有難度大。既往研究[9]表明，BMSCs復(fù)合異種骨基質(zhì)明膠可以有效修復(fù)大鼠橈骨缺損，在組織支架的誘導(dǎo)作用下可以促進(jìn)BMSCs向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而修復(fù)骨缺損。但是，這種方法需要符合特定條件的組織工程支架，也就是需要特殊的“土壤”，BMSCs這個(gè)“種子”才能更好的在其內(nèi)生長(zhǎng)并且分化。另外，臨床應(yīng)用的安全性有待調(diào)查[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒構(gòu)建基因載體轉(zhuǎn)染BMSCs后，不影響B(tài)MSCs表型，說(shuō)明利用基因工程原理構(gòu)建基因過(guò)表達(dá)的BMSCs也是提高“種子”有效分化的一種手段。本研究基于此理論構(gòu)建BMP-7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒慢病毒載體的BMSCs，制作新型“基因種子”，為骨缺損的研究做準(zhǔn)備。

近年來(lái)，干細(xì)胞的應(yīng)用受到明顯限制，主要存在以下幾個(gè)問(wèn)題[12]：① 干細(xì)胞易老化，存活代數(shù)較少；② 分化程度低，且分化方向不定，無(wú)法達(dá)到預(yù)想結(jié)果。后基因組時(shí)代的標(biāo)志是利用siRNA或者snRNA基因沉默或者過(guò)表達(dá)，從而增強(qiáng)或者沉默目的基因的功能。本研究的特色就是應(yīng)用基因修飾的分子原理構(gòu)建BMP-7的過(guò)表達(dá)載體，體外培養(yǎng)BMSCs，慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，探究BMP-7的過(guò)表達(dá)載體對(duì)干細(xì)胞的促成骨分化作用，以期為臨床上兒童骨髓炎導(dǎo)致的骨缺損的治療提供思路與方法。

BMP-7是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的一員[13-14]。有研究[15]利用重組骨形態(tài)發(fā)生BMP-7用于脊柱融合，可見BMP-7具有一定的安全性。既往研究[16]顯示，采用ALP作為前骨細(xì)胞的分子標(biāo)志物在前骨細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞的分化中起到重要作用。另外，Runx2也是一種成骨分化的分子標(biāo)志物[17]，可以與順式轉(zhuǎn)錄作用原件結(jié)合，從而促進(jìn)骨橋蛋白、骨涎蛋白的合成，進(jìn)而促進(jìn)骨細(xì)胞分化。本研究以ALP、Runx2、OCN作為成骨分化的標(biāo)志物，利用RT-PCR進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果表明慢病毒轉(zhuǎn)染BMP-7過(guò)表達(dá)載體后，ALP、Runx2、OCN的表達(dá)量明顯升高。ALP染色結(jié)果：轉(zhuǎn)染組肉眼可見紫色染色區(qū)域，鏡下可見ALP染色呈強(qiáng)陽(yáng)性；茜素紅染色結(jié)果：轉(zhuǎn)染組肉眼可見明顯紅色區(qū)域染色，鏡下可見大量鈣結(jié)節(jié)點(diǎn)。

綜上所述，慢病毒轉(zhuǎn)染BMP-7可以促進(jìn)BMSCs成骨分化。本研究的不足：① 轉(zhuǎn)染方法的選擇問(wèn)題。因?yàn)槁《据d體是一種滅活的人類免疫缺陷病毒，雖然轉(zhuǎn)染率較高，但安全性仍有待進(jìn)一步改進(jìn)。② 僅證明了BMP-7轉(zhuǎn)染后可以促進(jìn)BMSCs成骨分化，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。