李 青 王 博 邱弘毅 顏秀娟 程 莉 王倩倩 陳勝良

研究顯示，晝夜節(jié)律紊亂（如輪班制工作、時差旅行等）與消化系統(tǒng)疾?。òㄎ改c道功能紊亂等）密切相關[1]。流行病學資料表明，與上班時間規(guī)律的工作者比較，晝夜輪班者更易發(fā)生腸易激綜合征[2-3]。另有研究表明，輪班工作者發(fā)生胃癌、結直腸癌的風險顯著增高[4-6]。晝夜節(jié)律紊亂引發(fā)消化系統(tǒng)疾病的機制尚未明確，可能包括：（1）通過腦-腸互動紊亂引起胃腸運動、分泌等功能改變[7-9]；（2）伴隨食欲和進食節(jié)律改變，從而影響胃腸道的消化、吸收功能[10-11]；（3）通過應激反應導致機體免疫炎性反應狀態(tài)改變等[12-15]。以上機制可能導致腸道內(nèi)微生物和營養(yǎng)代謝物發(fā)生變化，經(jīng)腦-腸互動、體液環(huán)境改變等機制，最終影響機體的健康。目前有關晝夜節(jié)律紊亂改變腸道微生態(tài)及糞便代謝組學特征的報道較少。本研究通過建立晝夜節(jié)律紊亂小鼠模型，采用16S rRNA 測序法及靶向代謝組學分析，對比觀察了晝夜節(jié)律正常組（Con 組）和晝夜節(jié)律紊亂組（JL 組）小鼠腸道菌群及糞便代謝物的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取12 只健康C57BL/6J 小鼠（雄性，6～8周齡，18～25 g，購自上海交通大學實驗動物中心）作為研究對象，隨機分為2 組，每組6只。以燈光模擬晝夜節(jié)律，Con 組（n＝6）于6 ∶00 a.m.打開燈光，6 ∶00 p.m.關閉燈光；JL 組（n＝5，死亡1 只）按照文獻[16]所述方法進行明暗周期調(diào)整：JL 組小鼠在第1～3 天的光照時間為6 ∶00 a.m.～6 ∶00 p.m.，第 4 天光照時間段前移8 h（10 ∶00 p.m.～10 ∶00 a.m.），持續(xù)3 d 后，光照時間恢復至6 ∶00 a.m.～6 ∶00 p.m.。依此循環(huán)4 個月后，收集兩組小鼠的糞便及空腸內(nèi)容物，并立即置于液氮中速冷，然后于－80 ℃保存。

1.2 16S rRNA 測序

使用QIAamp 快速糞便DNA 小抽試劑盒（購自美國Qiagen 公司）提取細菌DNA，然后使用NanoDrop 2000 分光光度計（購自美國Thermo Scientific 公司）測量細菌DNA 的濃度。使用FastPfu 聚合酶及條形碼引物，對DNA 樣品進行PCR 擴增。使用凝膠（購自美國Axygen Biosciences公司）提取、純化擴增子，并使用QuantiFluorTM-ST熒光計（購自美國Promega 公司）進行定量。將純化后的擴增子以等摩爾濃度合并，使用 Illumina MiSeq 基因測序儀（購自美國Illumina 公司）進行末端配對測序。PCR 擴增反應條件：95 ℃預變性5 min；之后95 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，共25 個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。在美吉公司的免費在線平臺（www.majorbio.com）上進行 PCR 產(chǎn)品的高通量焦磷酸測序。

1.3 細菌分析

將16S rRNA 測序產(chǎn)物進行過濾、分離。在97%相似度水平下進行聚類，獲得操作分類單元（OTU），然 后 使 用 Greengenes 13.8 數(shù) 據(jù) 庫 對OTU 進行分類學注釋。使用α 多樣性指標OTU、Shannon 指數(shù)、Sobs 指數(shù)和Simpson 指數(shù)分析物種的多樣性。應用QIIME 軟件進行β 多樣性分析，使用R 語言工具繪制主成分分析（PCA）、主坐標分析（PCoA）和非度量多維尺度（NMDS）分析的結果圖。兩組間差異的分析釆用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 靶向代謝組學

糞便樣品的靶向代謝組學分析由麥特繪譜生物科技（上海）有限公司進行。糞便樣品的制備方法如文獻[17]所述。使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）系統(tǒng)（型號ACQUITY UPLC＋Xevo TQ-S，購自美國Waters Corp 公司）定量 11 種目標代謝物。應用MassLynx 4.1 軟件（購自美國Waters 公司）分析原始數(shù)據(jù)，并對每種代謝物進行峰積分、校準和定量。應用R-Studio 軟件進行統(tǒng)計學分析。使用PCA、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）識別兩組代謝物的差異。之后，在差異代謝物中尋找具有潛在生物學意義的標志物，其特征為：VIP（Variable influence on projection）＞1 和P＜0.05（Studentt檢驗或 Wilcoxon 檢驗）。

2 結果

2.1 晝夜節(jié)律紊亂對空腸菌群的影響

16S rRNA 測序結果顯示，空腸菌群產(chǎn)生了569 943 個原始讀本。如圖1 所示，韋恩圖表明兩組共有 913 個相同的OTU，另有216 個OTU 專屬于Con 組，77 個OTU 專 屬 于JL 組；Shannon 指數(shù)和Sobs 指數(shù)的稀釋性曲線表明，JL 組空腸菌群的豐度較Con 組降低；α 多樣性指數(shù)結果顯示，與Con 組比較，JL 組空腸菌群的多樣性降低，其中Shannon 指 數(shù) 下 降29.6%，Simpson 指 數(shù) 升 高167.7%，組間差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。如圖2 所示，PCoA 和NMDS 分析結果顯示，Con組和JL 組的空腸菌群明顯分為兩簇；但PCA 結果未顯示出明顯的分群。

圖 1 Con 組和JL 組小鼠空腸菌群組分、豐度和α 多樣性比較 A 空腸菌群組分的韋恩圖 B Sobs 指數(shù)稀釋性曲線 C Shannon 指數(shù)稀釋性曲線 D α 多樣性指數(shù)（Shannon 指數(shù)） E α 多樣性指數(shù)（Simpson 指數(shù)）

圖 2 Con 組和 JL 組小鼠空腸菌群的β 多樣性分析 A PCA B PCoA C NMDS 分析

物種組分分析結果顯示，與Con 組比較，在門水平，JL 組空腸中Bacteroidota門細菌豐度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），F(xiàn)irmicutes門細菌豐度增高，但兩組差異無統(tǒng)計學意義；在屬水平，JL組空腸中Ileibacterium屬細菌豐度增高（P＜0.05），Streptococcus屬、Bacteroides屬、Ruminococcus_torques_group屬、Faecalibacterium屬細菌豐度均降低（P均＜0.05）。 見圖3。

圖 3 Con 組和JL 組小鼠空腸菌群差異的比較 A 門水平差異比較的柱狀圖 B 門水平差異的t檢驗分析 C 屬水平差異比較的柱狀圖 D 屬水平差異的t檢驗分析

2.2 晝夜節(jié)律紊亂對結腸菌群的影響

16S rRNA 測序結果顯示，結腸菌群共產(chǎn)生了 551 482 個原始讀本。如圖 4 所示，韋恩圖表明兩組共有345 個相同的OTU，另有128 個OTU專 屬 于Con 組，82 個 OTU 專 屬 于JL 組；Rank-Abundance 曲線和Shannon 指數(shù)稀釋性曲線均表明，JL 組結腸菌群的豐度較Con 組降低；α 多樣性指數(shù)結果顯示，與Con 組比較，JL 組結腸菌群的多樣性降低，其中Shannon 指數(shù)下降11.9%（P＜0.05），Simpson 指數(shù)升高 65.1%，但僅有邊界統(tǒng)計學意義。如圖5 所示，根據(jù)β 多樣性距離矩陣進行層級聚類分析，Con 組和JL 組的結腸菌群明顯分為不同的兩簇。

圖 4 Con 組和JL 組小鼠結腸菌群組分、豐度和α 多樣性比較 A 結腸菌群組分的韋恩圖 B Rank-Abundance 稀釋性曲線 C Shannon 指數(shù)稀釋性曲線 D α 多樣性指數(shù)（Shannon 指數(shù)） E α 多樣性指數(shù)（Simpson 指數(shù)）

物種組分分析結果顯示，與Con 組比較，在門水平，JL 組結腸中Bacteroidota門細菌豐度顯著 降 低（P＜0.01），F(xiàn)irmicutes門（P＜0.05） 和Actinobacteria門（P＜0.000 1）細菌豐度均增高；在屬水平，JL 組結腸中norank_f_Muribaculaceae屬和Prevotellaceae_Ga6A1_group屬細菌豐度均降低（P均＜0.05），Ileibacterium屬、Turicibacter屬、Bifidobacterium屬、Enterorhabdus屬（P均＜0.01）和Eubacterium fissicatena group屬（P＜0.05）細 菌豐度均增高。見圖6。

2.3 晝夜節(jié)律紊亂對糞便代謝物的影響

應用UPLC-MS/MS 技術分析 Con 組和JL 組的糞便代謝物。如圖7 所示，與Con 組比較，JL 組糞便中氨基酸（14.11%比30.04%，P＜0.01）和吲哚（0.11%比0.20%，P＜0.01）的水平顯著降低。PCA、PLS-DA 及 OPLS-DA 聚類分析結果均顯示，兩組的糞便代謝物呈現(xiàn)出明顯分群。此外，與Con組比較，JL 組糞便中色氨酸（1 001.46±343.55 比2 185.52±502.33，P＜0.01）和吲哚-3-甲醛（IAId，802.04±509.31 比1 937.13±553.35，P＜0.01）的水平均顯著降低；兩組糞便中碳水化合物（32.45%比20.40%，P＞0.05）和 短 鏈 脂 肪 酸（31.95% 比29.05%，P＞0.05）的水平差異均無統(tǒng)計學意義。

圖 5 Con 組和JL 組小鼠結腸細菌β 多樣性分析 A PCA B PCoA C NMDS 分析

圖6 Con 組和JL 組小鼠結腸菌群差異的比較 A 門水平差異比較的柱狀圖 B 門水平差異的t檢驗分析 C 屬水平差異比較的柱狀圖 D 屬水平差異的t檢驗分析

圖 7 Con 組和JL 組小鼠糞便代謝物的差異分析 A PCA、PLS-DA 和OPLS-DA 聚類分析 B 兩組糞便代謝物差異比較柱狀圖 C 兩組糞便代謝物中色氨酸和IAId 的水平比較

3 討論

本研究結果表明，晝夜節(jié)律紊亂會導致腸道微生態(tài)及糞便代謝物發(fā)生變化。以往的研究主要聚焦于結腸和糞便菌群，有關晝夜節(jié)律紊亂對小腸菌群影響的報道較少。生理狀態(tài)下，空腸菌群與結腸菌群并不相同，其在吸收營養(yǎng)物質(zhì)（如碳水化合物、氨基酸、短肽、維生素等）方面發(fā)揮重要作用[18]。上消化道菌群紊亂（如小腸細菌過度生長）會導致多種消化不良癥狀，包括腹痛、腹瀉、腹脹和吸收不良等[19]。本研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂會導致空腸菌群的豐度和多樣性降低，且其中Firmicutes門與Bacteroidota門的比值升高，這一比值常作為判斷腸道菌群失衡的重要指標之一。有研究表明，與正常體質(zhì)量者比較，肥胖動物和人的糞便中Firmicutes門與Bacteroidota門的比值較高[20]。本研究結果所示空腸菌群改變可能與未知的消化道功能學及疾病狀態(tài)的機制相關聯(lián)，這有待進一步的針對性研究探討。

本研究結果顯示，晝夜節(jié)律紊亂可導致結腸菌群的豐度和多樣性降低，且其中Firmicutes門與Bacteroidota門的比值升高，Turicibacter屬細菌豐度增高。有研究表明，Turicibacter屬為促炎細菌，生酮飲食可使Turicibacter屬細菌豐度降低[21]。本研究結果指出，晝夜節(jié)律紊亂增高了結腸菌群中促炎細菌的占比，這對于晝夜節(jié)律紊亂可能通過加重腸道炎性反應程度而引發(fā)消化系統(tǒng)疾病的機制的探索，提供了有價值的思路。

以往糞便代謝組學研究結果表明，晝夜節(jié)律紊亂主要引起氨基酸代謝失常，其中色氨酸代謝紊亂與多種代謝及免疫性疾病相關，如炎癥性腸病、代謝綜合征等[22]。Islam 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸對于葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的結腸炎模型小鼠具有保護作用。另有研究表明，色氨酸的吲哚衍生物 IAId 可以保護腸黏膜的完整性并促進腸上皮增生[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，JL 組小鼠中色氨酸和IAId 的水平低于Con 組，這可能是晝夜節(jié)律紊亂引發(fā)腸道炎性反應及功能紊亂的機制之一。以往有關晝夜節(jié)律改變與糞便代謝組學的關系報道較少。研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因可調(diào)控多種代謝途徑，如脂質(zhì)合成和脂肪酸氧化過程，從而維持機體代謝穩(wěn)態(tài)[25]；同時，代謝物的利用和進食行為反過來也可以調(diào)整生物鐘[26]。進一步探究晝夜節(jié)律與細胞代謝的相互調(diào)節(jié)作用，可以為針對特定代謝紊亂的臨床治療提供新的見解。

本研究存在一定不足，如所構建的晝夜節(jié)律紊亂小鼠模型不能完全模擬現(xiàn)代人生活方式改變的特征，因此，研究結果不能代表真實世界人類晝夜節(jié)律紊亂所引發(fā)的變化情況；其次，本研究存在樣本量較小的局限性；此外，本研究未包括關于腸道菌群紊亂和糞便代謝組學改變的后續(xù)致病機制和（或）功能學研究。綜上所述，本研究的結果豐富了關于晝夜節(jié)律紊亂引發(fā)腸道微生態(tài)和糞便代謝組學改變的實驗數(shù)據(jù)，為今后進一步的研究儲備了有益的依據(jù)。