朱秀紅，李哲靜，張記鐘，張 萌，王明昆，茹廣欣

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，鄭州 450002）

近年來，隨著全球工業(yè)化的高速發(fā)展，工業(yè)“三廢”排放量越來越大，重金屬污染問題日益嚴(yán)重，其中鎘污染物點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)7.0%［1］，位居重金屬污染物含量排行榜第一。鎘毒性高、遷移性強(qiáng)且難降解，易被動植物和微生物吸收、轉(zhuǎn)移和富集，再通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體，嚴(yán)重?fù)p害人類健康［2］。植物修復(fù)具有成本低、二次污染易于控制、植被形成后具有保護(hù)表土、減少侵蝕和水土流失的功效等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)［3］。

鎘脅迫會誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），打破氧化還原反應(yīng)穩(wěn)態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到功能性損傷，從而影響植物生長代謝。為維持胞內(nèi)Redox 平衡，植物體通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及非蛋白巰基化合物含量、細(xì)胞壁固持和液泡區(qū)室化效應(yīng)［4，5］等方法提高植物耐 Cd 能力。泡桐（Paulownia fortunei）具有速生、豐產(chǎn)、生物量大、經(jīng)濟(jì)價值高、材質(zhì)優(yōu)良、繁殖容易、栽培歷史悠久、經(jīng)濟(jì)價值高等眾多優(yōu)點(diǎn)，但是國內(nèi)對泡桐的研究集中在遺傳選育與繁殖技術(shù)［6］、栽培與造林技術(shù)［7］、病蟲害防治［8］、黃酮類化合物提?。?］、生物質(zhì)燃料制備［10］等方面，有關(guān)泡桐在重金屬脅迫下的生長生理狀況鮮見報道。為此，本研究通過測定Cd 脅迫下泡桐毛白 33 號（Paulownia tomentosa×P.fortunei33）幼苗的［6］生理生化等特性，從植株和細(xì)胞兩個層次上探究泡桐毛白33 號對Cd 的吸收規(guī)律及耐Cd 原因，以期為該植物在重金屬污染修復(fù)方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020 年10 月下旬在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。泡桐毛白33 號種子經(jīng)H2O2消毒后，用去離子水浸種24 h 催芽，后置于發(fā)芽盒中待其萌發(fā)，等其長至兩葉一心后向發(fā)芽盒中加入1/5 Hongland 營養(yǎng)液促進(jìn)其生長，2～3 d 更換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)一周后將幼苗置于1/2 Hongland 營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，2～3 d 后移至Hongland 完全營養(yǎng)液中培養(yǎng)，每3 d 更換一次營養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

全營養(yǎng)液中培養(yǎng)30 d 后，選擇長勢一致茁壯的幼苗隨機(jī)分組，采用CdCl2為Cd 源加入營養(yǎng)液中對幼苗進(jìn)行Cd 脅迫處理。試驗(yàn)設(shè)置5 個處理，Cd 濃度分別為：0（CK）、10 mg/L（T1）、20 mg/L（T2）、30 mg/L（T3）和40 mg/L（T4），各處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)10株幼苗。連續(xù)Cd 脅迫15 d 后，收取樣品。

1.3 測試指標(biāo)與方法

泡桐毛白33 號各部位Cd 含量用原子吸收分光光度計(jì)（AASZEEnit700）測定；根系參數(shù)利用Epson根系掃描儀掃描，WinRhizo 軟件分析；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定，脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮法測定［11］；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）法測定［12］；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定［13］；過氧化氫酶（CAT）活性采用雙氧水法測定［14］；谷胱甘肽（GSH）含量測定參照Monostori 法，非蛋白巰基（NPT）含量測定參照Keltjens 法［15］，螯合肽（PCs）含量=NPT 總量－GSH 含量；亞細(xì)胞組分的提取參照Xin 等［16］的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2016 和SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素ANOVA 完成處理，利用Duncan 法進(jìn)行多重比較（α=0.05），Excel 2016 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd 脅迫下泡桐毛白33 號各部位Cd 含量

由表1 可知，不同濃度鎘處理下，Cd 含量均表現(xiàn)為根＞葉＞莖，且均隨Cd 脅迫濃度的升高而顯著增大。隨Cd 脅迫濃度的升高，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)及葉片富集系數(shù)呈降低趨勢，根部及莖部生物富集系數(shù)呈先顯著降低后顯著升高趨勢。

表1 不同濃度鎘處理下泡桐毛白33 號各部位的Cd 含量、生物富集系數(shù)及轉(zhuǎn)移系數(shù)

2.2 Cd脅迫下泡桐毛白33號根系形態(tài)及耐性指數(shù)

低濃度（10 mg/L）鎘處理下，每處理組平均根長、平均根表面積、平均根體積分別比對照增大3.53%、31.89%、25.00%（表2）。隨著鎘濃度的增大，以上各指標(biāo)相比對照均減小，40 mg/L 時達(dá)到最小值，分別為對照的68.16%、72.45%、66.67%，平均根尖數(shù)、平均根尖分叉數(shù)及耐性指數(shù)均減小。

表2 不同濃度鎘處理對泡桐毛白33 號根系形態(tài)及耐性指數(shù)的影響

T4 植株根部呈黑褐色，并伴有壞死現(xiàn)象，可見泡桐毛白33 號可承受低濃度Cd 脅迫，高濃度Cd 脅迫會抑制幼苗根系的正常生長發(fā)育。

2.3 Cd 脅迫 對泡桐 毛白 33 號 MDA 含 量及 Pro 含量的影響

MDA 含量可反映植物細(xì)胞膜脂過氧化程度，Pro 可清除活性氧自由基，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定，二者是衡量植物逆境生長的重要指標(biāo)［17］。由圖1 可知，泡桐毛白33 號幼苗體內(nèi)MDA 含量與Pro 含量整體與鎘濃度呈正相關(guān)。鎘濃度低于20 mg/L 時，葉片MDA 含量相比CK 先小幅上升，后下降至與CK 持平，根部MDA 含量相比CK 變化不顯著。鎘濃度為20 mg/L 時，根部和葉部中Pro 含量分別為對照的2.33、1.41 倍；當(dāng)鎘濃度提高到 40 mg/L 時，根部和葉部中MDA 含量和Pro 含量分別為對照的1.43、1.30倍和6.67、3.12 倍。試驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度鎘脅迫會顯著加重泡桐幼苗細(xì)胞膜脂過氧化程度，但同時，脯氨酸含量的升高可清除過量ROS，維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓及質(zhì)膜的完整性，增強(qiáng)植株抗逆能力。

圖1 鎘脅迫處理對泡桐毛白33 號MDA 含量和Pro 含量的影響

2.4 Cd脅迫對泡桐毛白33號抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）屬防御性酶，可清除活性氧。由圖2A 可知，鎘脅迫處理下，泡桐葉片SOD活性相比對照變幅較平穩(wěn)，活性基本穩(wěn)定。根部SOD 活性先降低后升高，當(dāng)Cd 處理濃度為10 mg/L時，根部SOD 活性比對照降低16.71%；但是當(dāng)Cd 濃度升高為40 mg/L 時，根部SOD 活性又高于對照。且總體來看，泡桐幼苗根部SOD 活性顯著高于葉片。

過氧化物酶（POD）是防止膜脂過氧化的關(guān)鍵酶。由圖2B 可知，相比對照，泡桐幼苗根部和葉片POD 活性與鎘濃度呈正相關(guān)。當(dāng)鎘濃度為40 mg/L時，根部和葉部中POD 活性分別為對照的1.71、2.50倍。且總體上泡桐幼苗根部POD 活性顯著高于葉片。

過氧化氫酶（CAT）與SOD、POD 具有協(xié)同作用，可清除植物通過呼吸作用和光合作用等活動產(chǎn)生的過氧化物。由圖2C 可知，泡桐葉部CAT 活性隨著Cd 濃度的升高先升高后下降，20 mg/L 鎘處理下，其活性達(dá)最高值，為對照的1.52 倍，鎘濃度升高為40 mg/L 時，其活性相比對照組變化不顯著；根部CAT活性變化與鎘濃度呈正相關(guān)，當(dāng)鎘濃度為40 mg/L時，根部CAT 活性為對照的2.33 倍?？傮w來看，泡桐幼苗葉片CAT 活性顯著高于根部。

圖2 鎘脅迫處理對泡桐毛白33 號抗氧化酶活性的影響

2.5 Cd 脅迫對泡桐毛白 33 號 NPT、GSH、PCs 含量的影響

由圖3A 可知，隨著鎘濃度的增大，泡桐毛白33號幼苗各部位NPT 含量均呈先上升后下降趨勢，且葉部變化趨勢顯著大于根部。當(dāng)鎘處理濃度為20 mg/L 時，根和葉中NPT 含量均達(dá)峰值，分別為1.61、2.54 μmol/g FW，分別為對照的 1.44 倍和 1.57倍；鎘處理濃度高于20 mg/L 時，各部位NPT 含量開始下降，但仍高于對照組。當(dāng)鎘處理濃度為40 mg/L時，根部和葉中NPT 含量達(dá)1.31、1.71 μmol/g FW，分別為對照的1.17 倍和1.06 倍。

由圖3B 可知，隨著鎘濃度的增大，泡桐幼苗各部位GSH 含量呈下降趨勢，不同于NPT 的是，根部GSH 含量高于葉部。與對照相比，鎘處理濃度分別為 10、40 mg/L 時，泡桐根部 GSH 含量下降 14.08%、47.18%，葉部含量下降8.26%、52.01%，根和莖葉的平均降幅分別為32.14%和27.16%。

由圖3C 可知，隨著鎘濃度的增大，泡桐幼苗各部位PCs 含量變化趨勢與NPT 相似，先上升后下降。當(dāng)鎘處理濃度為20 mg/L 時，葉部PCs 含量達(dá)峰值1.71 μmol/g FW，為對照的 4.17 倍；當(dāng)鎘處理濃度為30 mg/L 時，根部 PCs 含量達(dá)峰值 0.62 μmol/g FW，為對照的4.13 倍，且葉中PCs含量顯著高于根部。

圖3 鎘對泡桐毛白33 號NPT、GSH、PCs含量的影響

2.6 Cd脅迫下泡桐毛白33號亞細(xì)胞中Cd分布狀況

由圖4A 可知，泡桐幼苗莖葉中鎘主要分布在F1（細(xì)胞壁）和F3（可溶組分）中，二者分別占總量的50.61%～75.89%和12.74%～30.80%，在F2（細(xì)胞器）中占比較少，僅占11.37%～18.60%。隨著鎘脅迫濃度增大，在莖葉F1 中占比明顯增加，F(xiàn)3 中的占比降低，F(xiàn)2 中變化較小。

由圖4B 可知，泡桐根部鎘分布不同于莖葉部，升高的鎘可被F3（可溶組分）吸收，其次為F1（細(xì)胞壁），二者之和占鎘總量的89.94%～92.06%，F(xiàn)2（細(xì)胞器）中占比較少，僅占7.91%～10.06%。隨著鎘脅迫濃度的升高，鎘在泡桐根部F1 和F3 中的占比變化與莖葉部相同，F(xiàn)1 中占比從30.23%升高到64.17%，F(xiàn)3 中占比從61.78%下降到32.91%，F(xiàn)2 中變化不明顯。

圖4 泡桐毛白33 號各部位亞細(xì)胞組分Cd 所占比例

3 小結(jié)與討論

泡桐毛白33 號各部位鎘含量為根＞葉＞莖，隨著鎘濃度的升高，幼苗轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)及葉片富集系數(shù)呈降低趨勢，根部及莖部生物富集系數(shù)呈先顯著降低后略微升高趨勢，各處理下泡桐根部富集系數(shù)顯著大于莖部及葉片。說明泡桐毛白33 號根部對鎘的滯留及富集作用強(qiáng)于莖葉，從而減少鎘對地上部位的傷害，此結(jié)果與周振等［18］研究結(jié)果相符。

植物通過根系直接吸收礦質(zhì)營養(yǎng)及水分，因此植物遭受Cd 脅迫時，其根系最先受到影響［19］。Lux等［20］發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫首先抑制根系長度，這可能是因?yàn)榧?xì)胞骨架微管的解聚及染色體的畸變，導(dǎo)致分生細(xì)胞有絲分裂活性的降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度Cd 脅迫促進(jìn)幼苗根系根微毛的產(chǎn)生，增強(qiáng)了植株獲取養(yǎng)分和水分的能力，高濃度Cd 脅迫破壞了植物根系細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，阻礙根尖細(xì)胞正常分裂，表皮細(xì)胞的崩脫會導(dǎo)致未成熟細(xì)胞的死亡，植物吸收營養(yǎng)和水分的能力下降，生長代謝受到抑制，這與前人研究結(jié)果一致［21，22］。

MDA 含量可直接反映植物細(xì)胞膜脂過氧化程度，脯氨酸可清除活性氧自由基、維持細(xì)胞膜穩(wěn)定、儲存能量等，以滿足植株正常生長代謝，間接反映細(xì)胞損傷程度［23］。本試驗(yàn)中，泡桐根部和葉部MDA 含量及Pro 含量均與Cd 脅迫濃度呈正相關(guān)，但當(dāng)鎘濃度大于10 mg/L 時，Pro 含量才顯著高于對照，鎘濃度大于20 mg/L 時，MDA 含量才顯著高于對照。說明泡桐幼苗可抵抗低濃度鎘脅迫，高濃度鎘脅迫使幼苗體內(nèi)活性氧大量累積，導(dǎo)致膜脂過氧化程度加重，脯氨酸聯(lián)合其他抗氧化酶清除過量ROS，維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓及質(zhì)膜的完整性，增強(qiáng)植株抗逆能力。

植物體的抗氧化酶系統(tǒng)分為酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)，二者協(xié)同作用可及時有效地抵御多種理化因子脅迫、清除細(xì)胞內(nèi)活性氧、維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性［24］。本試驗(yàn)中，幼苗根部SOD 活性隨著鎘濃度的升高先下降后升高，根部POD 和CAT 活性隨著鎘脅迫濃度的升高而升高，且在鎘濃度大于10 mg/L 時顯著升高，這可能是因?yàn)椋萃└啃枰彌_時間去適應(yīng)鎘脅迫環(huán)境，導(dǎo)致根系SOD 活性降低，隨著鎘脅迫濃度的升高，3 種酶產(chǎn)生協(xié)同作用來降低重金屬鎘對泡桐根部細(xì)胞造成的傷害。泡桐幼苗葉片SOD活性無顯著變化，CAT 活性先升高后降低，POD 活性總體呈上升趨勢，這可能是因?yàn)榕萃┤~片可抵御低濃度鎘脅迫，在葉片遭遇高濃度鎘脅迫時，POD 和CAT 產(chǎn)生協(xié)同作用，聯(lián)合清除ROS 等物質(zhì)。

植物在抵御鎘脅迫時，其體內(nèi)產(chǎn)生的巰基化合物會緩解植物受毒害程度［25］。本試驗(yàn)中，泡桐各部位NPT 和PCs 含量先升高后降低，GSH 降低的同時PCs 顯著增加，說明低濃度鎘脅迫可誘導(dǎo)合成NPT和PCs，植物通過消耗較多的GSH 合成PCs 用于抵抗鎘脅迫，且葉部NPT 和PCs 含量明顯高于根部，說明鎘促進(jìn)泡桐地上部分非蛋白巰基化合物的合成，使-SH 基團(tuán)免受金屬毒性而不被氧化。隨著鎘濃度的升高，三者含量顯著降低，這是由于高濃度Cd 加劇了植物細(xì)胞過氧化損傷，植物體內(nèi)ROS 產(chǎn)生和清除動態(tài)失衡，從而誘導(dǎo)合成NPT 和PCs 及GSH 的能力下降，最終表現(xiàn)為抑制生長。這與Mahdavian等［26］研究結(jié)果一致。

泡桐幼苗各部位Cd 主要貯存在細(xì)胞壁中，其次是可溶組分，二者之和在莖葉占比為81.41%～88.63%，根部位占比為89.94%～92.06%，這是因?yàn)榕萃┘?xì)胞壁中多糖、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素等物質(zhì)對重金屬離子的吸附固持，減少了金屬離子的跨質(zhì)膜運(yùn)輸，降低原生質(zhì)體中的金屬離子濃度，提高植株抗逆能力［27］。當(dāng)細(xì)胞壁對Cd2＋吸收達(dá)飽和狀態(tài)，Cd 將進(jìn)入可溶組分?？扇芙M分中檸檬酸、植物絡(luò)合素、金屬硫蛋白、硝酸和蘋果酸等物質(zhì)與游離Cd2＋相結(jié)合，形成一種活性很弱的螯合態(tài)，從而避免造成細(xì)胞器損傷，甚至功能性喪失［28］，此為液胞區(qū)室化效應(yīng)。前述可知，鎘主要積累在泡桐根部，而根部細(xì)胞壁和細(xì)胞液又是保留鎘的主要組分，降低了鎘向泡桐地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少了對植株的傷害。因此，泡桐毛白33 號的耐Cd 機(jī)制是植物通過細(xì)胞壁固持和細(xì)胞液區(qū)室化實(shí)現(xiàn)對Cd 的固定、絡(luò)合、再分配達(dá)到緩解Cd脅迫對細(xì)胞產(chǎn)生的毒害，從而增強(qiáng)泡桐毛白33 號對重金屬Cd 的耐性和富集能力。這與水稻［29］、龍葵［30］的耐Cd 機(jī)理相似。

綜上所述，鎘脅迫下，泡桐毛白33 號各部位Cd2+含量、根長、根體積、根表面積先增大后減小，呈現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，體現(xiàn)了植物在逆境中自我保護(hù)的能力；泡桐根為富集鎘的主要場所，大大降低了鎘對地上部的傷害；鎘脅迫損害了泡桐幼苗根部和葉片細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，其自身通過增強(qiáng)抗氧化酶活性來緩解細(xì)胞膜受傷害程度，Pro 的積累維持了細(xì)胞滲透壓平衡，細(xì)胞壁固持和液泡區(qū)隔化作用及非蛋白巰基類化合物對鎘的螯合是泡桐重要的耐鎘原因。