于飛?楊育華?趙陽?通訊作者：黃天壬

摘要：目的：探究HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變對人肝癌HepG2細胞自噬的影響。方法：體外培養(yǎng)人肝癌 HepG2細胞;將HepG2細胞隨機分為慢病毒空白載體（陰性對照）組、HBX-wt（野生型）組，HBX-A1762T/G1764A（實驗）組。實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）法檢測各組細胞 LC3B、P62、Beclin-1的表達情況;蛋白印跡分析法檢測各組細胞LC3B、Beclin-1、P62蛋白的表達情況。結果：與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1基因表達水平升高（P <0.05），P62水平降低（P<0.05）;與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1蛋白表達水平升高（P <0.05），P62蛋白表達水平降低（P<0.05）。結論：HBV X區(qū) A1762T/G1764A雙突變可能調控了肝癌HepG2激活了細胞自噬的發(fā)生。HBV X區(qū) A1762T/G1764A突變可能是HBV所致HCC診斷和治療的潛在靶點。

關鍵詞：肝癌，HBV，HBX 區(qū)A1762T/G1764A突變，自噬

【中圖分類號】R575 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）10--02

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC簡稱肝癌）是世界最常見的惡性腫瘤之一。在全球范圍內(nèi)，已有20多億人感染了乙肝病毒，全球HCC病例中大約53%與HBV感染有關[1]。一些報道也表明，乙肝病毒的遺傳特征，包括乙肝病毒的基因型和特定的基因突變，與肝細胞癌的發(fā)生有關[2-5]。HBx由HBV的X開放閱讀框編碼，在肝癌的發(fā)生過程中起著至關重要的作用。有研究表明， HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變是肝細胞癌發(fā)生的獨立危險因素[6]。HBV X 區(qū)的A1762T/G1764A突變?yōu)橛胁町惖臒狳c突變，差異有統(tǒng)計學意義[7]。

自噬是一種保守的過程，通過這種過程，細胞質物質包括錯誤折疊的蛋白質、受損的細胞器和各種入侵的病原體被移除，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[8]。有研究表明，HBx可以直接與第III類磷脂酰肌醇3-激酶I（PtdIns3K）結合，增強PtdIns3K的酶活性，并在Huh7.5細胞中誘導病毒DNA復制的自噬[9]。本研究在體外建立了人肝癌細胞HBX突變模型，以探討HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變對人肝癌HepG2細胞株自噬的影響，為肝癌治療提供可能的新靶點。

1 ? 材料與方法

1.1主要材料與試劑

人肝癌HepG2細胞株，課題組前期購買。特級澳洲胎牛血清、DMEM高糖型細胞培養(yǎng)基：美國Gbico公司。逆轉錄試劑盒以及qRT-PCR試劑盒：日本TaKaRa 公司。慢病毒表達載體HBX-A1762T/G1764A突變組、HBx野生型組、陰性對照組。HBX、PI3K、AKT、mTOR基因引物：上海生工生物工序股份有限公司。乙型肝炎病毒X多克隆抗體：美國Abcam公司。beta-Actin Rabbit mAb、LC3B Rabbit mAb、P62 Rabbit mAb、Beclin-1 Rabbit mAb：美國CST公司。

1.2 ?細胞分組和轉染

HepG2細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖型細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中。待細胞密度約為30%-50%時，按慢病毒使用說明書進行轉染。實驗分組：（1）轉染慢病毒空白載體的陰性對照組（NC），轉染含HBX野生基因型序列的野生型組（WT），轉染含HBX野生基因序列發(fā)生A1762T/G1764A位點聯(lián)合突變的實驗組（EG）。

1.3 ?RT-qPCR實驗檢測HBX、LC3B、P62、Beclin-1的表達

按照Trizol試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，逆轉錄得cDNA，然后按照qRT-PCR試劑盒說明進行PCR擴增。PCR反應條件為：95 °C變性10min，60°C退火 30s、72 °C延伸 40min，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算HBX、LC3B、P62、Beclin-1表達水平。引物序列見表1。

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1.4 ?Western blot檢測HBx、LC3B、P62、Beclin-1蛋白表達

收集各組細胞，加入RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白。取30μg蛋白樣品行SDS?PAGE凝膠電泳，轉膜、快速封閉液封閉后，加入一抗HBx、LC3B、P62、Beclin-1、β-actin （1∶1 000），4℃搖床孵化過夜;次日洗膜后加入1∶2000稀釋的山羊抗兔IgG作為二抗，室溫孵化1 h，TBST洗滌后，加入ECL顯色發(fā)光，凝膠成像儀成像。以為β-actin內(nèi)參，Image J軟件測定蛋白灰度值，計算各組各蛋白相對表達量。

1.5 ?統(tǒng)計學方法

以統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 8.0分析實驗數(shù)據(jù)并進行繪圖，計量資料以平均數(shù)±標準差（） 描述，多組間比較使用單因素方差分析，進一步兩組間比較行LSD-t檢驗，當P<0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。

2 ?結果

2.1 ?HepG2細胞慢病毒轉染驗證

將提取的總蛋白進行Western blot分析，結果如圖1所示：陰性對照轉染組未見任何條帶，而HBX-wt、HBX-A1762T/G1764A組在相對分子質量約為17KD處存在顯著條帶，見圖1。以上結果說明成功構建了HepG2細胞模型。

2.2 ?HBX突變對HepG2細胞LC3B、P62、Beclin-1基因表達的影響

與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組細胞LC3B、Beclin-1基因表達水平升高（P <0.05），P62基因表達水平降低（P<0.05），見表2。

2.3 ?HBX A1762T/G1764A突變對HepG2細胞LC3B、P62、Beclin-1蛋白表達情況的影響

與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1蛋白表達水平升高（P <0.05），P62蛋白表達水平降低（P<0.05）。見圖1。

3 ?討論

乙肝病毒感染仍然是一個主要的公共衛(wèi)生問題，在世界范圍內(nèi)造成顯著的發(fā)病率和死亡率。約20億人，即世界人口的三分之一，有過去或現(xiàn)在感染過乙肝病毒的血清學證據(jù)，目前約有3.5億人持續(xù)感染[2]。慢性乙肝可導致慢性活動性肝炎、肝硬變和肝癌[3]。因此，探究HBV在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用及機制，并在此基礎上尋找有效的措施防治HCC尤為重要。

自噬是一種分解代謝過程，通過引導陳舊/受損的細胞器（如線粒體）、蛋白質聚集體和病原體進行溶酶體降解來維持細胞的動態(tài)平衡。溶酶體分解的產(chǎn)物（例如氨基酸和脂肪酸）被回收，并通過溶酶體膜運輸?shù)郊毎|中。這些代謝物可以在蛋白質和三磷酸腺苷的生產(chǎn)中重復使用[10]。在新陳代謝壓力或營養(yǎng)供應不足的時期，自噬迅速上調，以維持能量生產(chǎn)，并為基本的細胞功能提供基石。同樣，缺乏葡萄糖或氨基酸或暴露在低氧環(huán)境中的細胞依賴自噬生存[11-12]。自噬缺陷導致蛋白質在肝臟中積累，導致肝臟腫大、肝細胞死亡和肝功能衰竭[13]。HBV感染能夠誘導肝細胞自噬反應，但誘導自噬反應的關鍵位點及具體是抑制還是激活作用目前處于探索之中。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組、HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組HepG2細胞LC3B、Beclin-1基因表達水平升高（P <0.05），P62基因表達水平降低（P<0.05）。與此同時HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1蛋白表達水平升高（P <0.05），P62蛋白表達水平降低（P<0.05）。提示HBX的A1762T/G1764A雙突變可能在HepG2細胞的自噬過程中起到促進作用，從而在HBV所致的HCC中起到了一定的作用。

綜上所述 HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變可能通過促進HepG2細胞的自噬，影響了肝癌細胞的細胞學功能，從而可能促進HCC的發(fā)生發(fā)展。

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基金項目：廣西自然科學基金資助（編號：2019GXNSFDA245001）