萬光儀，孫維良，武 超

(1. 安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院， 合肥 230601；2. 安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院， 合肥 230601)

0 引 言

碲以及其化合物在冶金、玻璃生產(chǎn)、制藥、橡膠硫化、電子工業(yè)等各個領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[1-2]。而碲納米顆粒(Te NPs)具有更大比表面積、高壓電性、高熱電性能、高光電導(dǎo)性和非線性光學(xué)特性等獨(dú)特特性，引起了世界各國研究者的關(guān)注[3-5]。

傳統(tǒng)納米碲的合成方法主要有物理法、化學(xué)法，物理法所需設(shè)備昂貴以及能耗高，化學(xué)法常常伴隨著有毒或危險化學(xué)品的使用[6](如水合肼、酚類、有機(jī)醇)。而利用微生物合成的納米顆粒有簡單、廉價、結(jié)構(gòu)可控制和友好等優(yōu)點(diǎn)[7]。這使研究人員篩選出清潔、無毒、環(huán)保的合成納米碲的生物資源。Amoozegar等[8]從含鹽環(huán)境樣品中分離中度嗜鹽菌Salinicoccussp.QW6、B Zihayatd[9]在溫泉中分離的Pseudomonaspseudoalcaligenes均可合成Te NPs。

由于納米顆粒巨大的比表面積，具有超強(qiáng)的活性及更強(qiáng)的組織滲透性，其殺菌作用是普通材料的數(shù)百倍[10]。范月圓等利用多粘類芽孢桿菌制備納米銀及其抑菌活性的研究[11]，Tran和Webster對硒納米材料抗菌潛力的研究[12]。

本研究利用皮特不動桿菌(Acinetobacterpittii)還原Te(Ⅳ)，并通過一系列物理化學(xué)表征證明該菌株合成了Te納米棒(Te NRs)。并利用Te NRs進(jìn)行了抗菌性能[16]的研究以及其催化PMS降解RhB的性能的研究，為Te NRs在水污染治理方面提供了新的方向。

1 實(shí) 驗

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

皮特不動桿菌(Acinetobacterpittii)，革蘭氏陰性菌(Escherichiacoli)和革蘭氏陽性菌(Bacillussubtilis)

1.1.2 試劑

亞碲酸鈉(Na2TeO3)、過一硫酸氫鉀復(fù)合鹽(PMS)、C5H10NaS2·3H2O(DDTC)、Tris-HCl(pH=7.0)，羅丹明B，所有試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：Trypone 10 g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L。需要固體培養(yǎng)基時，加入瓊脂 18.0 g/L。

礦物鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.46 g/L，(NH4)2SO40.255 g/L，MgSO4·7H2O 0.024 g/L，K2HPO40.225 g/L，KH2PO40.225 g/L，Hepes 4.766 g/L，微量元素5 mL/L；pH=7.0。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)以及Te(Ⅳ)的還原

將Acinetobacterpittii接種到50 mL LB培養(yǎng)基，在30 ℃、150 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；然后在6 000 r/min，5 min條件下離心收菌，用礦物鹽培養(yǎng)基清洗3次后，重懸，將初始濃度OD600=1.0的菌液接種至礦物鹽培養(yǎng)基中。同時加入40 mmol/L 果糖和終濃度為0.1 mmol/L的Na2TeO3，在37 ℃、150 r/min的搖床中避光培養(yǎng)還原Te(Ⅳ)。在探究Te(Ⅳ) 還原時的影響因素時，除因素條件外，其他反應(yīng)條件保持不變。

1.2.2 Te(Ⅳ)測定方法

溶液中亞碲酸鹽的測定方法采用文獻(xiàn)[17]中描述的 DDTC方法：取1 mL培養(yǎng)液在9 700 g下離心10 min，依次加入0.5 mol/L Tris-HCl(pH=7.0)溶液3 mL和10 mmol/L DDTC溶液1 mL，混勻，室溫避光反應(yīng)10 min后測定OD340 nm。

1.2.3 Te NRs的表征

使用TEM透射電子顯微鏡在加速電壓為200 kV的條件下獲得了Acinetobacterpittii合成Te NPS的照片。使用配備了EDX(能量色散X射線)微分析儀的SEM(PhilipsXL30，16 kV)裝置觀察Acinetobacterpittii的表面特征以及分析生物合成的Te NRs樣品的表面和元素組成，并通過聚焦在Te NRs的簇上記錄了EDS光譜。采用紫外-可見分光度計(型號Vertex80+Hyperion 2000)在200～800 nm 的波長范圍內(nèi)記錄純化的Te NRs的紫外-可見光譜。利用 X射線衍射儀(型號為*STADIVARI)，在0.1541 nm的CuKa輻射下、2θ=10°～90°，對生物合成Te NRs的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。

1.2.4 Te NRs的純化

為了獲得Te NRs，在9 700 g下離心10 min收集含有Te NRs的培養(yǎng)物，沉淀用PBS洗滌3次，再重新懸浮于無菌去離子水中，放入冷凍研磨儀中研磨(60 Hz，24 min)。細(xì)胞破碎后，將懸浮液以3 500 g離心10 min，保留上清液，棄去含有細(xì)胞碎片的沉淀。將獲得的黑色膠體懸浮液透析過夜，最后用0.22 μm濾頭過濾，得到Te NRs溶液。

1.2.5 Te NRs的抗菌性能

純化后的Te NRs使用電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)定量。利用不同濃度Te NRs(6，12，24，48 mg/L)對革蘭氏陽性細(xì)菌(Bacillussubtilis)和革蘭氏陰性細(xì)菌(E.coli)進(jìn)行了抑菌圈實(shí)驗，并用24 mg/L Te NRs對以上兩種細(xì)菌處理2.5 h，使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察細(xì)菌的形態(tài)學(xué)變化，研究Te NRs的抗菌性能。

1.2.6 Te NRs催化PMS氧化降解RhB

向25 mL錐形瓶中加入20 mg/L的RhB溶液， 再加入0.06 g/L Te NRs 和0.04 g/L PMS。在150 r/min、35 ℃恒溫水浴振蕩，每隔0.5 h取出樣品，用0.45 μm濾頭過濾，并立即用分光光度計在λmax=554 nm處測定吸光度，實(shí)驗設(shè)置3組平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株合成Te NRs

菌株Acinetobacterpittii在含0.5 mmol/L Te(Ⅳ)和不含Te(Ⅳ)的平板和還原培養(yǎng)基中好氧培養(yǎng)48 h后，結(jié)果如圖1所示。 在無Te(Ⅳ)的情況下平板(圖 1(a))和培養(yǎng)基(圖 1(c))無黑色物質(zhì)產(chǎn)生；而添加 Te(Ⅳ)的平板(圖 1(b))和培養(yǎng)基(圖 1(d))的顏色會變黑。此外，在非生物對照中Te(Ⅳ)并未發(fā)生任何變化，證實(shí)了黑色元素Te是Te(Ⅳ)還原的產(chǎn)物。這種現(xiàn)象以前也有[18-19]報道，黑色是Te(0)累積的結(jié)果。

圖1 Acinetobacter pittii在含 0.5 mmol/L Te(Ⅳ)(a,c)或不含 Te(Ⅳ)(b,d)的瓊脂平板和礦物鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng) 48 h 后 的生長情況Fig 1 Growth of Acinetobacter Pittii cultured for 48 h on agar plate and mineral salt medium containing 0.5 mmol/L Te(Ⅳ) or without Te(Ⅳ)

2.2 合成Te NRs的影響因素

圖2顯示，Acinetobacterpittii合成Te NRs的最佳Na2TeO3濃度和pH分別為0.1 mmol/L和8(圖2a，b)。當(dāng)初始Na2TeO3濃度為0.5 mmol/L，Acinetobacterpittii對Te(Ⅳ)的還原量最高(約0.42 mmol/L)。當(dāng)初始Te(Ⅳ)濃度繼續(xù)升高至1 mmol/L，Te(Ⅳ)還原率急劇下降，這是由于Te(Ⅳ)的毒性導(dǎo)致細(xì)菌活性的下降。Acinetobacterpittii可以在較大的pH范圍內(nèi)還原Te(Ⅳ)，pH值為7.0～9.0時，Te(Ⅳ)的還原率都超過80%，但是當(dāng)pH下降6.0時，Te(Ⅳ)還原速率明顯降低，推測在酸性環(huán)境下菌生長受到抑制，導(dǎo)致其還原能力的降低。

圖2 不同初始Te(Ⅳ)濃度(a)以及不同pH條件(b)下Te(Ⅳ)的還原率(b)Fig 2 Reduction rate of Te(Ⅳ) under different initial Te(Ⅳ) concentrations and different pH conditions

2.3 Te NRs的表征

掃描電鏡(SEM)分析表明，Acinetobacterpittii為短棒狀，(長度為1.7～2.6 μm，直徑為0.7～0.9 μm)(圖3(a))。透射電鏡(TEM)分析表明，Te NRs形態(tài)主要為棒狀結(jié)構(gòu)，直徑在50～100 nm之間(圖3(b))，同時成功純化出Te NRs(圖3(c))。對Te NRs的EDS分析清楚地揭示元素碲在3.72 keV處的顯著峰，Cu產(chǎn)生的峰值是由于Te NRs滴于銅網(wǎng)上造成(圖3(d))。

圖3 Acinetobacter Pettii合成Te NRs的掃描電子顯微鏡圖(a)、透射電子顯微鏡圖(b)，純化后Te NRs的透射電子顯微鏡圖(c)，Te NRs的能譜圖(d)Fig 3 SEM and TEM of the synthesis of Te NRs by Acinetobacter Pittii, TEM of purified Te-NRs, and EDS spectrum of Te NRs

圖4(a)是制備的Te NRs的紫外可見光譜,發(fā)現(xiàn)在210 nm處的有明顯的吸收峰。已有文獻(xiàn)證實(shí)Te NRs的特征峰是由于表面等離子共振(SPR)[20]，證明Te NPs的存在。圖4(b)給出Te NRs的X射線衍射譜，XRD 圖譜通過和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的卡片比對后，發(fā)現(xiàn)符合Te的標(biāo)準(zhǔn)卡(ICDD卡號36-1452)，特征峰值出現(xiàn)在27.56°、28.26°、40.44°、43.33°和 49.62°分別對應(yīng)于Te納米晶體的晶面(101)、(102)、(110)、(111)和(201)，這證明得到的Te NRs以晶體的形式存在[21]。由XPS(圖3(c))可知Te元素的峰由Te3d3/2和Te3d5/2兩個峰組成，其結(jié)合能分別為583.1和573.1 eV，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比可知Te為0價。由XPS(圖4(c))可知Te元素的峰由Te3d3/2和Te3d5/2兩個峰組成，其結(jié)合能分別為583.1和573.1 eV，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比可知Te為0價。

圖4 Te NRs的紫外可見(a)，X透射衍射(b)，X射線光電子能譜(c)，傅里葉紅外圖譜(d)Fig 4 UV-vis, XRD, XPS, FT-IR images of Te NRs

紅外光譜圖(圖4(d))揭示Te NRs與細(xì)胞表面化學(xué)基團(tuán)之間可能存在的物理和化學(xué)相互作用。Te NRs表面的有機(jī)官能團(tuán):3 377 cm-1處的吸收峰(O-H伸縮)，2 929 cm-1(C-H反對稱伸縮)，1 658 cm-1(C=C伸縮)，1 550 cm-1(COO-反對稱伸縮)，1 237cm-1(多糖和磷脂中的P=O伸縮)、1 070cm-1(肽聚糖C-O和P-O伸縮)。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)、多糖的氨基、羰基和羥基官能團(tuán)參與Te NRs的生物合成。

2.4 Te NRs的抗菌實(shí)驗

圖5為抑菌圈實(shí)驗，圖5(a)、(c)分別為大腸桿菌與芽孢桿菌的對照組(孔內(nèi)為無菌水)，圖5(b)、(d)分別為大腸桿菌與芽孢桿菌在Te NRs不同濃度下(單位：mg/L)的生長情況。此圖表明Te NRs對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均具有一定的抑制效應(yīng)。而且加入相同濃度的Te NRs，對大腸桿菌的抑菌圈明顯大于同等條件下芽孢桿菌的抑菌圈，說明Te NRs對革蘭氏陰性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陽性菌；這是由于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁厚具有更強(qiáng)的抵抗能力[22]。這在表1的最低抑菌濃度(MIC)也有體現(xiàn)。

圖5 抑菌圈實(shí)驗：大腸桿菌(a、b)，芽孢桿菌(c、d)Fig 5 Bacteriostatic zone test: E. coli and Bacillus

表1 Te NRs最低抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentration of Te NRs

為了進(jìn)一步研究Te NRs對細(xì)菌細(xì)胞的影響，通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察到有無Te NRs處理的細(xì)菌的形態(tài)學(xué)變化。選擇革蘭氏陽性(Bacillussubtilis)和革蘭氏陰性(E.coli)作為模型細(xì)菌。如圖6所示，未經(jīng)處理的芽孢桿菌和大腸桿菌細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞壁光滑。在用Te NRs孵化2.5 h后，兩者細(xì)胞表面受損和褶皺，推測Te NRs抗菌機(jī)制是其破壞細(xì)菌細(xì)胞壁或膜，這表明Te NRs可以用于抗菌應(yīng)用。

圖6 無Te NRs和24 mg/L Te NRs處理大腸桿菌(a,b)和芽孢桿菌(c,d)2.5h后的SEM圖像Fig 6 Typical SEM images of E. coli and Bacillus cells without and with Te NRs treatment at 24 mg/L for 2.5 h

2.5 Te NRs對過硫酸鹽降解RhB的催化性能

2.5.1 RhB在不同體系中的降解情況以及Te NRs/PMS體系降解RhB的影響因素

為了確定生物源Te NRs作為過一硫酸氫鉀復(fù)合鹽(PMS)催化劑的潛力，我們討論了RhB自身以及在Te NRs、PMS、Te NRs/PMS 3種體系中的降解，并評價其催化性能(圖7(a))。RhB本身不降解，僅添加Te NRs時，RhB也不降解。單獨(dú)加入PMS，RhB降解緩慢，150 min內(nèi)僅降解53%。在Te NRs/PMS中，RhB在150 min內(nèi)降解95%以上，在180 min內(nèi)完全降解。

圖7 RhB在不同體系中的降解情況 (a)c(RhB)=20 mg/L,c( Te NRs)=0.12 g/L,c( PMS)=0.4 g/L, pH=7;影響Te NRs/PMS系統(tǒng)降解的因素 (b)Te NRs濃度，c(RhB)=20 mg/L, c(PMS)=0.4 g/L, pH=7, 35℃; (c)pH，c(RhB)=20 mg/L,c( PMS)=0.4 g/L,c( Te NRs)=0.12 g/L, 35℃; (d)溫度，c(RhB)=20 mg/L, c(PMS)=0.4 g/L, pH=7, c(Te NRs)=0.12 g/LFig 7 Degradation of RhB in different systems

2.5.2 降解途徑分析

圖8 (a)淬滅實(shí)驗c(RhB)=20 mg/L,c( TeNRs)=0.12 g/L, c(PMS)=0.4 g/L, pH=8, 35℃, c(BQ)=500 mmol/L, c(EtOH)=500 mmol/L, c(TBA)=500 mmol/L; (b)Rhb在TeNRs/PMS體系中降解的紫外可見光譜Fig 8 (a) Quenching experiment: c(RhB)=20 mg/L, c( TeNRs)=0.12 g/L, c(PMS)=0.4 g/L, pH=8, 35℃, c(BQ)=500 mmol/L, c(EtOH)=500 mmol/L, c(TBA)=500 mmol/L;(b) UV-Vis spectra of Rhb degradation in TeNRs/PMS system

3 結(jié) 論