王 聰, 沈思平，光善儀，徐洪耀

(1. 東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201620;2. 東華大學(xué) 分析測試中心與材料學(xué)院，纖維改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201620)

0 引 言

谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)一種必需的硫醇，在生理功能、維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原活性、異生物質(zhì)代謝、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控中起主要作用[1-2]。細(xì)胞內(nèi)GSH含量異常與多種疾病有關(guān)，如癌癥、心血管、阿爾茨海默病、衰老、心臟病等疾病[3-5]，特別是癌細(xì)胞中GSH的含量明顯高于正常細(xì)胞[6-7]。因此，開發(fā)快速、簡單和高選擇性的方法來檢測 GSH是非常必要的。目前檢測GSH的方法主要包括利用高效液相色譜 (HPLC)[8]、伏安法[9-10]、電化學(xué)分析[11-12]、傅里葉變換紅外光譜 (FTIR)、毛細(xì)管電泳 (CE)、質(zhì)譜和熒光光譜等[13-15]。其中，小分子熒光探針因其靈敏度高，操作簡單，穩(wěn)定性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，成像好等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[16-17]。羅丹明B及其衍生物是以氧雜蒽為母體的堿性呫噸類熒光染料，當(dāng)它的衍生物螺環(huán)打開時(shí)會(huì)引起熒光“開關(guān)”現(xiàn)象，同時(shí)伴隨熒光顏色變化[18-20]，所以實(shí)現(xiàn)對GSH的特異性檢測一直是羅丹明類探針研究的熱點(diǎn)。

本文以羅丹明B酰肼與3,3′-二硫代二丙酸為原料設(shè)計(jì)并合成了一種新型的對谷胱甘肽(GSH)具有特異性識別功能的二硫熒光分子RNSS。通過對RNSS進(jìn)行熒光光譜性能研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)RNSS的乙腈溶液中加入GSH后，在561 nm光激發(fā)下其在585 nm處出現(xiàn)很強(qiáng)的粉色熒光，并且其對GSH的熒光響應(yīng)具有高選擇性以及高靈敏性同時(shí)還具備較強(qiáng)的抗干擾能力，該研究可為之后對GSH的檢測提供新思路。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器：DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；Nicolet8700型傅里葉變換紅外光譜儀；Bruker AMX-600型核磁共振測定儀； LS55型熒光光度儀。

試劑：二氯亞砜，無水乙腈，二氯甲烷，谷胱甘肽均為分析純；所用原料3,3′-二硫代二丙酸，羅丹明 B和水合肼均為分析純；羅丹明酰肼為實(shí)驗(yàn)室自制；實(shí)驗(yàn)室用水均為去離子水。

1.2 探針RNSS的合成

在250 mL三口燒瓶中加入3,3′-二硫代二丙酸(40.0 g, 190.0 mmol,)，在常溫下氮?dú)夥諊?，緩慢滴加亞硫酰?85.0 mL, 1.1 mol)。加熱回流反應(yīng)16 h，最終反應(yīng)溶液為淡黃色。[21]真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去過量的亞硫酰氯，產(chǎn)率98%。1H NMR (600 MHz, 303 K, DMSO): δ 2.62 (t, 7.0 Hz, 4H)，2.87 (t,J=7.0 Hz, 4H) ppm。

準(zhǔn)確稱取羅丹明酰肼(0.0459 g, 0.1 mmol)和無水K2CO3(0.0138 g, 0.1 mmol)并將其溶解在二氯甲烷(10.0 mL)中，逐滴加入3,3′-二硫代丙酰氯(0.0219 g, 0.1 mmol)的二氯甲烷溶液(5.0 mL),30 ℃在氮?dú)鈿夥障路磻?yīng)24 h。過濾，將濾液用二氯甲烷與飽和食鹽水萃取，并用無水硫酸鈉干燥過夜。過濾后減壓旋蒸濃縮得到紫色固體。利用柱層析(CH2Cl2∶CH3OH=100∶1)進(jìn)行純化，最終得到淺紫色固體(RNSS)，產(chǎn)率為51%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.59 (s, 2H), 7.82 (s, 2H), 7.57 (td,J=7.5, 1.4 Hz, 3H), 7.53 (td,J=7.4, 1.2 Hz, 2H), 7.05～6.98 (m, 2H), 6.46 (d,J=8.5 Hz, 4H), 6.30 (s, 4H), 6.29 (s, 4H), 3.29 (dd,J=7.0, 2.1 Hz, 16H), 2.55 (t,J=7.3 Hz, 4H), 2.31 (t,J=7.4 Hz, 4H), 1.06 (t,J=7.0 Hz, 24H)。

圖1 合成路線Fig 1 Synthetic route

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感材料RNSS的光學(xué)性能

圖2為RNSS的紫外-可見光譜圖。RNSS本身在500 nm之后沒有任何吸收，在加入GSH后，在557 nm處呈現(xiàn)一個(gè)明顯的吸收峰。另外，通過手持紫外燈照射，我們發(fā)現(xiàn)加入GSH后，探針RNSS的乙腈/水(1∶1)溶液中有明顯的粉色熒光產(chǎn)生，而RNSS本身并無熒光。因此，實(shí)驗(yàn)測試了在乙腈/水(1∶1)溶液中，RNSS+GSH的激發(fā)和發(fā)射光譜。如圖3所示，在561 nm處激發(fā)時(shí)，加入GSH后的RNSS溶液的最大吸收波長為585 nm。因此化合物RNSS可以用作識別GSH的熒光傳感材料。

圖2 在CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中，RNSS和RNSS+GSH的紫外-可見吸收光譜Fig 2 UV-vis absorption spectra of RNSS and RNSS+GSH in CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution

圖3 在CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中，RNSS+GSH的激發(fā)和發(fā)射光譜Fig 3 Excitation and emission spectra of complex [RNSS+GSH] in CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution

2.2 RNSS熒光傳感材料的靈敏性

在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，激發(fā)波長為561 nm的條件下，進(jìn)行了GSH對探針RNSS的熒光滴定實(shí)驗(yàn)。如圖4所示，探針RNSS(濃度為1×10-3mol/L)隨著GSH(濃度為1×10-3mol/L)的逐漸加入在585 nm處出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，并且熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)GSH的加入量達(dá)到1.0當(dāng)量時(shí)，增加趨勢減緩，之后不再隨GSH的加入增加而增加，這表明該探針與GSH是以1∶1進(jìn)行反應(yīng)的。

圖4 在CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中加入(0～100 μmol/L)GSH后，探針RNSS的熒光發(fā)射光譜圖。(內(nèi)插圖為585 nm處體系對應(yīng)的不同熒光強(qiáng)度點(diǎn))Fig 4 The fluorescence emission spectrum of the probe RNSS after adding (0-100 μmol/L) GSH to the CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution (the inset is the different fluorescence intensity points corresponding to the system at 585 nm)

在滴定曲線實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，可得到在585 nm處的F/F0與GSH濃度之間的線性回歸方程，如圖5其線性回歸方程為y=0.508x-1.914，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.988，根據(jù)DL=3σ/K，其中σ為探針平行測試20次的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K為線性回歸方程的斜率，可計(jì)算出檢出限為6.063×10-6mol/L。圖6表示相對熒光強(qiáng)度的倒數(shù)1/[F-F0]與GSH濃度倒數(shù)1/[GSH ]的線性關(guān)系曲線,根據(jù) Benesi-Hildebrand[18]方程，通過圖中斜率和截距計(jì)算得到配位常數(shù)為Ka=1.341×104,由此表明探針RNSS與GSH體系可以穩(wěn)定存在。

圖5 相對熒光強(qiáng)度F/F0和GSH濃度的線性關(guān)系曲線Fig 5 Linear relationship curve between relative fluorescence intensity F/F0 and concentration of GSH

圖6 相對熒光強(qiáng)度的倒數(shù)1/[F-F0]和1/[GSH]的線性關(guān)系曲線Fig 6 The linear relationship curve between 1/[F-F0]and [1/GSH]

2.3 RNSS熒光傳感器對氨基酸選擇性和競爭性

之后，在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，探針濃度保持100μmol/L，分別加入21種常見的氨基酸(100μmol/L)(L-Arg、L-His、L-Ala、L-Gly、Cys、L-Val、L-Pro、L-Leu、L-Phe、L-Ser、L-Met、L-Glu、L-Asp、L-Lys、L-Thr、L-Tyr、GSH、L-Asn、L-Trp、L-lle、L-Gln)，對其熒光光譜性能進(jìn)行測試。如圖7所示，在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，激發(fā)波長為561 nm的條件下，與其他氨基酸相比探針在加入GSH后，其在585 nm處有顯著的熒光增強(qiáng)。該熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針RNSS是對GSH具有高度選擇性的熒光探針。

圖7 CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中加入不同氨基酸(100 μmol/L)時(shí)，探針RNSS(100 μmol/L)的熒光發(fā)射光譜圖Fig 7 Fluorescence emission spectra of probe RNSS (100 μmol/L) with different amino acids (100 μmol/L) added to CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution

此外，為了進(jìn)一步研究其他氨基酸是否對RNSS與GSH配合物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，分別在RNSS+GSH配合物溶液中加入其他氨基酸，結(jié)果如圖8所示。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入其他氨基酸之后，溶液在585 nm處的熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化。因此，配體對GSH的選擇性識別具有良好的抗干擾能力，從而可以作為一種選擇性識別GSH的熒光探針。

圖8 在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，分別向探針RNSS(100 μmol/L)和探針RNSS(100 μmol/L)+GSH(1 mmol/L)體系中加入不同氨基酸(100 μmol/L)時(shí)585 nm處的熒光強(qiáng)度Fig 8 In the CH3CN/H2O (v/v=1∶1) solution, when different amino acids (100 μmol/L) are added to the probe RNSS (100 μmol/L) and probe RNSS (100 μmol/L) + GSH (1 mmol/L) system respectively, at 585 nm Fluorescence intensity

2.4 探針RNSS對GSH的檢測機(jī)理

為進(jìn)一步探究探針RNSS與GSH的檢測機(jī)理，采用Job-plot曲線實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行研究。固定探針RNSS與GSH的總濃度為200 μmol/L，改變兩者之間的比值測定體系的熒光強(qiáng)度。如圖9所示，兩者之間比例為1∶1時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。因此可以確定探針RNSS與GSH以1∶1的形式進(jìn)行反應(yīng)的。進(jìn)一步支持了滴定曲線分析的結(jié)果。綜上所述，可以推斷出GSH是以1∶1的方式與探針RNSS發(fā)生取代反應(yīng)，促進(jìn)螺旋體內(nèi)酯開環(huán)，釋放出羅丹明發(fā)色團(tuán)，使熒光顏色由無色變?yōu)榉凵?。開環(huán)過程預(yù)計(jì)是由于先前發(fā)現(xiàn)的螺環(huán)內(nèi)酰胺羰基和谷胱甘肽部分的游離氨基之間的氫鍵作用，如圖10所示[22]。

圖9 探針RNSS與GSH的Job-plot曲線Fig 9 Job-plot curve of probe RNSS and GSH

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)合成了一種新型的帶有二硫鍵的羅丹明類化合物RNSS，該分子在乙腈溶液中可以作為熒光探針對GSH進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在探針中加入等量GSH后，在585 nm處出現(xiàn)明顯的粉色熒光，并且不會(huì)受到其他氨基酸離子的干擾，說明該探針具有較好的靈敏性和高選擇性，其檢出限可以達(dá)到6.063×10-6mol/L。配位常數(shù)為Ka=1.341×104，表明探針RNSS與GSH體系可以穩(wěn)定存在。綜上所述，RNSS可作為有效檢測GSH的一種光學(xué)探針材料。本研究為今后 GSH新型探針分子的研究及其未來生物應(yīng)用研究提供了重要思路。