陳玥彤，張閃閃，李文意，于文浩，趙曉芳，劉婷婷,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省糧食精深加工與高效利用工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.吉林省糧食精深加工與副產(chǎn)物高效利用技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食用菌加工技術(shù)集成科研基地，吉林 長(zhǎng)春 130118）

黑木耳（Auricularia auricula）是我國(guó)重要的藥食同源真菌，其中多糖為其主要的活性成分，高達(dá)70%以上[1]。相關(guān)研究表明黑木耳多糖具有抗氧化[2]、抗癌[3]、提高免疫[4]等多種功能活性，其生物活性取決于它們的結(jié)構(gòu)特征，包括單糖組成、糖苷鍵類型、分支結(jié)構(gòu)和構(gòu)象特征等[5]。目前相比于多糖的物理修飾，化學(xué)修飾（例如硫酸鹽修飾、磷酸鹽修飾、羧甲基修飾等）更能提高其生物活性[6]。其中磷酸化修飾是多糖支鏈結(jié)構(gòu)中羥基被游離的磷酸根基團(tuán)取代的過程，由于磷酸根帶3個(gè)負(fù)電荷，通過增強(qiáng)多糖的電負(fù)性影響多糖的某些活性[7]。Chen Ling等[8]將南瓜多糖進(jìn)行磷酸化修飾，發(fā)現(xiàn)磷酸化可使其體外抗氧化活性增強(qiáng)。Deng Chao等[9]報(bào)道磷酸化處理可擴(kuò)展多糖的鏈構(gòu)象，明顯增強(qiáng)其抗腫瘤活性。此外，大量研究表明抗氧化活性往往與降血糖作用具有一定的相關(guān)性，對(duì)食用菌多糖進(jìn)行磷酸化修飾有助于推動(dòng)降血糖等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用。

調(diào)查顯示，我國(guó)目前有9 300萬(wàn)糖尿病患者[10]。糖尿病是指一組以高血糖水平長(zhǎng)期維持為特征的代謝性疾病[11]，市場(chǎng)上用于糖尿病的降糖藥物主要為雙胍類、阿卡波糖和沃格利波糖，這些藥物雖然可增加葡萄糖的儲(chǔ)存或抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性，但也有一定的副作用，如腸胃氣脹和腹瀉等[12]。相關(guān)研究表明，食用菌多糖是治療糖尿病的有效途徑。但有關(guān)磷酸化修飾多糖降血糖活性研究卻鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以黑木耳多糖為原料進(jìn)行磷酸化修飾，并對(duì)其結(jié)構(gòu)及體外降血糖活性進(jìn)行表征與評(píng)價(jià)，以期為黑木耳高值化利用和新型功能性食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳 吉林省博林生物科技有限公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 瑞典Pharmacia公司；α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 上海源葉生物科技有限公司；三偏磷酸鈉（sodium trimetaphosphate，STMP）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）、濃硝酸、三羥甲基氨基甲烷、鉬酸銨、無水乙醇、三氯甲烷等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IR Prestige-21傅里葉紅外光譜儀、SSE-550掃描電子顯微鏡 日本島津公司；UV210紫外-可見光分光光度計(jì)美國(guó)Unico公司；1515型高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；AV600核磁共振儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳多糖的制備

稱取5 g 120 目黑木耳粉，料液比1∶70（g/g），高壓反應(yīng)釜內(nèi)提?。?.0 MPa、110 ℃、60 min），離心，Sevag法脫蛋白（6次），經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量為5%以下時(shí)進(jìn)行濃縮、醇沉、凍干即為黑木耳多糖，記為AAP。

1.3.2 磷酸化黑木耳多糖的制備

參照Duan Zhen等[13]的方法，略作修改。分別稱取5 g STPP、2 g STMP溶解于超純水中，配制70 mg/mL的磷酸化試劑。加入AAP 1 g、硫酸鈉5 g，溶解后調(diào)節(jié)pH值至9.0，分別在60、70、80、90 ℃反應(yīng)5 h。樣液透析（8 000～14 000 Da）48 h后，濃縮凍干即為磷酸化黑木耳多糖，記為PAAP-1、PAAP-2、PAAP-3、PAAP-4。

1.3.3 磷酸化黑木耳多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.3.1 磷酸根含量的測(cè)定

采用鉬藍(lán)比色法[14]測(cè)定，取5 mL樣液通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定其磷酸根含量。

1.3.3.2 分子質(zhì)量測(cè)定

將2.0 mg/mL AAP及PAAP-（1～4）多糖溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，然后注入高效凝膠滲透色譜儀。測(cè)試條件：高效液相色譜儀Ultrahydrogel 500、Ultrahydrogel 2000色譜柱（7.8 mmh300 mm）；示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相為0.1 mol/L超純水；流速0.5 mL/min；柱溫和檢測(cè)器溫度均為35 ℃，進(jìn)樣量25 μL[15]。

1.3.3.3 單糖組成測(cè)定

多糖的衍生：將水解干燥后的AAP及PAAP-（1～4）加入1 mL吡啶，1 mL硅烷化試劑，于70 ℃恒溫干燥箱中反應(yīng)30 min。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-17（30 mh0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度280 ℃，氫火焰離子化檢測(cè)器溫度300 ℃，載氣為氮?dú)?，柱?3.0 kPa，柱流量1.00 mL/min，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL[16]。

1.3.4 磷酸化多糖的結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.4.1 紫外光譜分析

將AAP與PAAP-（1～4）分別配制成1 mg/mL溶液置于比色皿中，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描[17]。

1.3.4.2 剛果紅實(shí)驗(yàn)

稱取5 mg多糖純品AAP、PAAP-（1～4）溶解于2 mL超純水中，取2 mL剛果紅（80 μmol/L）溶液與不同體積的1 mol/L NaOH溶液配制為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaOH溶液。采用紫外-可見光分光光度計(jì)在波長(zhǎng)400～600 nm范圍內(nèi)記錄最大吸收波長(zhǎng)[18]。

1.3.4.3 紅外光譜分析

分別稱取2 mg AAP及PAAP-（1～4）與200 mg烘干至恒質(zhì)量的KBr研磨均勻，壓片，收集范圍為4 000～400 cm-1的紅外光譜[19]。

1.3.4.4 掃描電鏡測(cè)定

取一定質(zhì)量的AAP及PAAP-（1～4）純品平鋪于導(dǎo)電膠，吹去未粘住的多糖粉末，放入離子濺射儀真空噴金30 s，再將樣品置于電子顯微鏡下（1h10-5Pa、20 kV）觀察，選取合適區(qū)域拍照[20]。

1.3.4.5 核磁共振波譜分析

取AAP及PAAP-（1～4）以D2O為溶劑加入到核磁管中，在600 MHz核磁共振譜儀上測(cè)定，探針溫度為60 ℃；掃描次數(shù)16次；空掃次數(shù)0次；脈沖角度30°；弛豫延遲時(shí)間1.0 s[21]。

1.3.5 磷酸化多糖體外降血糖活性測(cè)定

1.3.5.1 抑制α-淀粉酶活性

采用DNS比色法[22]測(cè)定，對(duì)AAP及PAAP-（1～4）進(jìn)行α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定，按式（1）計(jì)算抑制率：

式中：A0為以等體積蒸餾水取代待測(cè)溶液吸光度；A1為以等體積磷酸鹽緩沖液取代α-淀粉酶溶液吸光度；A2為以等體積蒸餾水和磷酸鹽緩沖液分別取代待測(cè)溶液和α-淀粉酶溶液吸光度。

1.3.5.2 抑制α-葡萄糖苷酶活性

參照張夢(mèng)晴[23]的方法，對(duì)AAP及PAAP-（1～4）進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定，按式（2）計(jì)算抑制率：

式中：A1為樣品吸光度；A0為以磷酸鹽緩沖溶液代替多糖溶液的吸光度；A2為測(cè)定磷酸化黑木耳多糖溶液反應(yīng)體系的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以 fs表示，采用SPSS 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸化多糖的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 黑木耳多糖磷酸根含量的測(cè)定結(jié)果

黑木耳多糖中磷酸根含量作為磷酸化修飾程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，其生物活性取決于磷酸根含量的多少[24]。由表1可以看出，磷酸根含量隨反應(yīng)溫度的升高逐漸遞增，在90 ℃時(shí)磷酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.49%。這是因?yàn)槟芰康纳邥?huì)使高分子鍵的活性增強(qiáng)，磷酸化試劑的利用率也會(huì)隨之增加。

表1 不同溫度修飾下黑木耳多糖磷酸根含量Table 1 Phosphate contents of A.auricularia polysaccharides modified at different temperatures

2.1.2 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

多糖的生物活性與分子質(zhì)量之間相互關(guān)聯(lián)，因此對(duì)AAP及PAAP-（1～4）相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。由表2可以看出，PAAP的相對(duì)分子質(zhì)量明顯低于AAP。低分子質(zhì)量多糖通過抑制腸道內(nèi)碳水化合物的降解對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用[25]，這也為修飾后黑木耳多糖降血糖活性升高提供理論依據(jù)。隨溫度升高磷酸化黑木耳多糖相對(duì)分子質(zhì)量明顯降低，其多分散指數(shù)接近1，說明AAP及PAAP的平均相對(duì)分子質(zhì)量分布集中，純度較高。

表2 AAP及PAAP-1、PAAP-2、PAAP-3、PAAP-4的高效凝膠滲透色譜測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of HPGPC analysis of AAP, PAAP-1, PAAP-2,PAAP-3 and PAAP-4

2.1.3 磷酸化多糖的單糖組成

如圖1所示，利用高效液相色譜分析，與標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生后的保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，AAP主要是由Rib、Fuc、Xyl、Fru、Man、Gal、Glu組成的雜多糖，其構(gòu)成單糖基的物質(zhì)的量比為0.6∶0.41∶1.1∶1.18∶19.72∶0.74∶18.09。PAAP-（1～4）主要由Fuc、Xyl、Fru、Man、Gal、Glu組成的雜多糖，雖其相互間具有相似的單糖組成，但構(gòu)成單糖基的物質(zhì)的量比有所差異，分別為0.57∶1.31∶1.31∶13.03∶1.18∶27.78（PAAP-1），0.27∶2.03∶2.14∶20.62∶0.57∶18.04（PAAP-2），0.43∶1.55∶2.01∶14.06∶0.73∶20.69（PAAP-3），0.36∶0.52∶1.42∶1.62∶20.35∶0.94∶22.88（PAAP-4）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)單糖（a）與AAP（b）、PAAP-1（c）、PAAP-2（d）PAAP-3（e）和PAAP-4（f）的色譜圖Fig.1 GC chromatograms of mixed standards of monosaccharides (a)as well as AAP (b), PAAP-1 (c), PAAP-2 (d), PAAP-3 (e), and PAAP-4 (f)

2.1.4 紫外光譜分析

圖2顯示AAP及PAAP-（1～4）在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處均無明顯的吸收峰，因此可以說明黑木耳多糖及磷酸化修飾多糖核酸和蛋白質(zhì)含量較低。黑木耳多糖經(jīng)修飾后形成了化學(xué)鍵束縛，從而導(dǎo)致紫外吸收強(qiáng)度有所減弱，其峰值明顯降低。

圖2 AAP及PAAP-（1～4）的紫外光譜掃描Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of AAP and PAAP-1, 2, 3 and 4

2.1.5 剛果紅實(shí)驗(yàn)

剛果紅有序的螺旋構(gòu)象可與多糖結(jié)合形成絡(luò)合物，通過紫外-可見最大吸收波長(zhǎng)是否紅移測(cè)定有無三股螺旋結(jié)構(gòu)。相關(guān)文獻(xiàn)表明，多糖的構(gòu)象以螺旋形式存在時(shí)，將發(fā)揮較為關(guān)鍵的功能活性，其螺旋結(jié)構(gòu)中存在的β-1,3-分支殘基，可提高抗氧化及抗腫瘤活性[26]。如圖3可知，AAP與剛果紅對(duì)照組相比無明顯差異，但多糖經(jīng)磷酸化修飾后，磷酸根發(fā)生了取代反應(yīng)在低NaOH濃度下最大吸收波長(zhǎng)極具增加，說明其發(fā)生了分子間作用力變化，具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。因此可以猜測(cè)，磷酸化黑木耳多糖與β-1,3-糖苷鍵形成三螺旋構(gòu)象時(shí)可提高多糖的生物活性，為后續(xù)體外降糖研究提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖3 不同NaOH濃度下剛果紅和AAP、PAAP-（1～4）紫外-可見光最大吸收波長(zhǎng)變化Fig.3 Maximum absorption wavelengths of Congo red and AAP,PAAP-1, 2, 3 and 4 under different NaOH concentrations

2.1.6 紅外光譜分析

如圖4可以看出，AAP及PAAP吸收峰為典型的多糖吸收峰[27]，黑木耳多糖修飾前后主體結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。在3 336 cm-1處吸收峰主要是由OüH所引起，磷酸化修飾后吸收峰明顯增強(qiáng)，這是由于修飾后的氫鍵和主鏈長(zhǎng)度被破壞，暴露出更多的氫鍵和烷基鍵。取代的磷酸根帶有2個(gè)—OH，增加了修飾后多糖的—OH個(gè)數(shù)，從而增加了其水溶性，使其具有更強(qiáng)的活性。2 921 cm-1附近處AAP及PAAP出現(xiàn)的中等強(qiáng)度吸收峰歸屬于CH2不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1 617 cm-1處的弱吸收峰歸因于C＝O振動(dòng)。不同的是磷酸修飾后多糖在1 205 cm-1附近處出現(xiàn)P＝O鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，在898 cm-1附近處出現(xiàn)PüOüC鍵的特征吸收峰，這是由于羥基轉(zhuǎn)化為磷酸基團(tuán)所導(dǎo)致，因此可以表明磷酸化多糖修飾成功。

圖4 AAP和PAAP-（1～4）的紅外光譜掃描Fig.4 IR spectra of AAP and PAAP-1, 2, 3 and 4

2.1.7 掃描電鏡分析

由圖5所示，AAP的主要形態(tài)為表面均勻的致密片層結(jié)構(gòu)，碎片大且平整光滑，無卷曲，部分出現(xiàn)堆積現(xiàn)象。這說明AAP的分子質(zhì)量偏大，形態(tài)均一，分子間作用力大。PAAP-（1～4）的掃描電鏡圖與AAP相比呈細(xì)小碎片狀，隨溫度的升高磷酸化多糖呈現(xiàn)蜷曲狀，說明其分子間作用力降低，氫鍵作用力減小與紅外推測(cè)相吻合。同時(shí)與黨參多糖修飾前表面光滑，有不規(guī)則和交錯(cuò)的條紋，而修飾后表面粗糙不平，且有很多凸起的球體結(jié)果相似[28]。磷酸化修飾改變了多糖的空間形態(tài)，這與其與生理活性密切相關(guān)[29]。

圖5 AAP及PAAP-（1～4）掃描電鏡圖Fig.5 SEM micrographs of AAP and PAAP-1, 2, 3 and 4

2.1.8 核磁共振分析

PAAP-4的磷酸根含量較高，因此選取PAAP-4進(jìn)行核磁測(cè)定。因磷酸鹽為弱電子吸收基團(tuán)，磷酸化衍生物的13C核磁共振與非衍生多糖相似[30]。由圖6可以看出，AAP的C3、C5、C2、C4在δ69～76處，δ60.46為C6的化學(xué)位移，經(jīng)磷酸化修飾后，C6的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)至δ69.27，這與碳信號(hào)附著在吸電子的磷酸基上時(shí)，會(huì)向低場(chǎng)移動(dòng)結(jié)果一致。由此表明磷酸化修飾在C6位置上發(fā)生了取代反應(yīng)。

圖6 AAP（A）與PAAP（B）13C核磁共振譜圖Fig.6 13C NMR spectra of AAP (A) and PAAP (B)

利用31P核磁共振進(jìn)行譜圖分析，如圖7所示，相比AAP，PAAP在δ0.94、-8.19處出現(xiàn)新的信號(hào)峰，說明多糖中有2個(gè)不同位置的羥基被磷酸基取代，進(jìn)一步驗(yàn)證磷酸化修飾成功。

圖7 AAP（A）與PAAP（B）31P核磁共振譜圖Fig.7 31P NMR spectra of AAP (A) and PAAP (B)

2.2 磷酸化多糖體外降血糖活性

2.2.1α-淀粉酶抑制率

α-淀粉酶能夠催化淀粉、糖原和低聚糖α-1,4-糖苷鍵的水解，將二糖轉(zhuǎn)化為單糖，導(dǎo)致餐后血糖水平急劇升高[31]。由圖8可知，在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，PAAP-4和AAP的抑制率分別為41.08%和31.47%，PAAP-4較AAP的抑制率提高了10.03%，二者的IC50分別為5.835、3.038 mg/mL，可知同條件下，PAAP-4對(duì)α-淀粉酶的抑制能力達(dá)AAP樣液的1.92 倍?？捎行ㄟ^抑制α-淀粉酶活性從而抑制高聚糖的分解，達(dá)到降血糖目的[32]。

圖8 AAP及PAAP-（1～4）對(duì)α-淀粉酶的抑制率Fig.8 Inhibition rates of AAP and PAAPs on α-amylase

2.2.2α-葡萄糖苷酶抑制率

研究表明多糖與酶的結(jié)合導(dǎo)致α-葡萄糖苷酶的極性和分子構(gòu)象發(fā)生變化，部分酶活性喪失[32]。由圖9可知，隨著AAP及PAAP-（1～4）質(zhì)量濃度的升高，α-葡萄糖苷酶的抑制率也隨之增加。質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，PAAP-4和AAP的抑制率分別為56.89%和47.88%，PAAP-4較AAP的抑制率提高了9.01%，二者的IC50分別為27.22、10.66 mg/mL，可知同條件下，PAAP-4對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力達(dá)到AAP樣液的2.55 倍。

圖9 AAP及PAAP-（1～4）對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.9 Inhibitory effects of AAP and PAAPs on α-glucosidase

3 結(jié) 論

對(duì)加壓剪切聯(lián)合萃取的黑木耳多糖進(jìn)行磷酸化修飾，當(dāng)反應(yīng)溫度為90 ℃修飾下磷酸根含量最高，為8.49%。紅外光譜顯示黑木耳多糖修飾后出現(xiàn)了磷酸基團(tuán)的特征峰，修飾后多糖相對(duì)分子質(zhì)量明顯下降，剛果紅實(shí)驗(yàn)表明修飾后黑木耳多糖出現(xiàn)三股螺旋結(jié)構(gòu)。核磁共振光譜分析結(jié)果表明磷酸化修飾主要發(fā)生在C6位的羥基上，且在δ0～1.5處出現(xiàn)了磷酸基團(tuán)中P的信號(hào)峰。掃描電鏡顯示不同溫度下磷酸化多糖出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象，相比修飾前呈現(xiàn)細(xì)小碎片狀，與相對(duì)分子質(zhì)量結(jié)果相吻合。體外降糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同修飾后磷酸化多糖較未修飾前均具有更強(qiáng)的體外降血糖活性。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，PAAP-4活性最高且對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率分別為56.89%和41.08%。黑木耳多糖經(jīng)過磷酸化修飾后其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了衍生，磷酸化后的供氫能力增加從而降糖活性發(fā)生改變。以上為進(jìn)一步研究磷酸化黑木耳多糖提供了理論依據(jù)，但目前磷酸化黑木耳多糖的降血糖作用機(jī)理還不明確，仍需進(jìn)一步探討研究。