唐莉華 黃學娣 熊 躍 黃 寬 李 凡

在外力作用下，破壞了骨或軟骨的完整性和連續(xù)性者，稱為骨折，屬于中醫(yī)“骨傷”范疇。由于外因(直接外力、間接外力、撕脫暴力、累積性力)和內(nèi)因(解剖結(jié)構(gòu)、年齡、病理因素、職業(yè)因素)等病因，可造成開放性和閉合性骨折。臨床主要癥狀為局部疼痛、腫脹和功能障礙(握持、站立、行走等功能的喪失)[1]。清代沈金鰲在《雜病源流犀燭》中指出：“凡人忽跌忽閃挫，必氣為之震，震則激，激則壅，壅則氣凝聚一處……氣運乎血，血本隨氣以周流，氣凝則血亦凝矣……氣滯血瘀，則作腫作痛，諸變百出……故跌撲閃挫，其傷在外而病必及內(nèi)，其氣必壅，其血必凝……為之行氣，為之行血，不得徒從外涂抹之已也……輕者，頓挫氣血，凝滯作痛，當導氣行血而已。若重者，傷筋折骨，必須接續(xù)”[2]?？倒菍庮w粒由龍血竭、當歸、川芎、陳皮、生地黃、赤芍、乳香、沒藥、續(xù)斷、骨碎補等中藥組方而成，具有活血祛瘀、行氣止痛、消腫生肌、接骨續(xù)筋等作用[3-5]。此成藥方由江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科謝水華主任醫(yī)師根據(jù)沈金鰲的“接骨紫金丹”(載于《雜病源流犀燭》)，結(jié)合自身多年臨床經(jīng)驗化裁而成，在治療四肢骨折疾病方面，具有獨特的療效。在保證療效的前提下，該藥已經(jīng)進行了制劑工藝的研究，但還未建立指標性成分的質(zhì)量控制標準。為了彌補康骨寧顆粒的不足之處，此研究參考《中華人民共和國藥典》[6]與文獻研究[7，8]中關(guān)于橙皮苷含量測定的方法，應用HPLC法測定康骨寧顆粒中橙皮苷的含量，為制定康骨寧顆粒的質(zhì)量控制標準，提供科學的實驗依據(jù)。以保障臨床應用的安全性、有效性和制劑的質(zhì)量可控性，從而進一步提高臨床的療效及治愈率。

1 材料

1.1 儀器高效液相色譜儀、自動進樣器、紫外檢測器(Agilent 1260)；電子分析天平(ESJ182-4，沈陽龍騰電子有限公司)；恒溫干燥箱(202-2-S，上海躍進醫(yī)療器械廠)；超聲波清洗機(KQ2200B，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑康骨寧顆粒(批號：20200701-20200710，自制)，對照品橙皮苷(批號：110721-202019，中國食品藥品檢定研究院)，乙腈為色譜純試劑(賽諾菲世爾科技(中國)有限公司)，水為自制超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：安捷倫C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以乙腈為流動相A，以水(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3)為流動相B，按照表1程序進行梯度洗脫。流速：1.0 ml·min-1，柱溫：30 ℃ ，檢測波長：283 nm；進樣量：10 μl，理論板數(shù)按橙皮苷峰計算應不低于2000。見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液的制備取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加入80%甲醇(體積分數(shù)為80%的甲醇水溶液，以下相同)溶解，并稀釋制成每1 ml含橙皮苷25 μg的溶液，即得對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取康骨寧顆粒適量，研細(過4號篩)并混勻，取約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中。精密加入25 ml的80%甲醇溶液，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率300 W，頻率40 kHz)，取出后放冷，再稱定重量。用80%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻并濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照品溶液的制備按康骨寧顆粒原處方比例稱取缺陳皮的中藥飲片，按照其制劑工藝制備陰性樣品，再按照“2.3”項下的供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.5 專屬性試驗分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液以及缺陳皮陰性對照溶液各10 μl，按照“2.1”項下色譜條件分別進行測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。試驗結(jié)果表明，供試品溶液色譜(圖1B)中與對照品色譜(圖1A)中在相同的保留時間(橙皮苷保留時間約10 min)有對應的色譜峰，理論塔板數(shù)符合要求，并與其他各峰達到基線分離，陰性樣品色譜(圖1C)中在相同保留時間(10 min)無對應的色譜峰。表明本方法專屬性良好，陰性對照色譜不干擾測定。

注：橙皮苷對照品(A)、康骨寧顆粒供試品(B)和缺陳皮陰性樣品(C)。圖1 色譜圖

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關(guān)系考察分別精密吸取對照品溶液(橙皮苷濃度為26.13 μg·ml-1)2 μl、5 μl、8 μl、10 μl、15 μl、20 μl注入高效液相色譜儀中，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。并以橙皮苷的進樣量作為橫坐標(X)，以峰面積作為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，進行線性回歸，得到回歸方程為Y=0.9148X+4.5012，R=0.9998。試驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明，橙皮苷的進樣量在52.26～522.60 ng范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6.2 精密度試驗精密吸取橙皮苷的對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別重復進樣6次進行測定，并記錄峰面積，計算其相對標準偏差為0.18%。試驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明，儀器的精密度良好，能滿足含量測定的要求。

2.6.3 重復性試驗取康骨寧顆粒(批號：20200701)6份，每份約1 g，按照“2.3”項下的方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，計算橙皮苷平均含量為0.64 mg/g，其相對標準偏差為0.73%。試驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明，該測定方法的重復性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性實驗取康骨寧顆粒(批號：20200701)約1 g，按照“2.3”項下的方法制備供試品溶液，于室溫放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h時，精密各吸取10 μl供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算相對標準偏差為1.67%。試驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明，供試品溶液在室溫條件下放置24 h以內(nèi)，其穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗取康骨寧顆粒(批號：20200701，每1 g含橙皮苷0.64 mg)6份，精密各稱定0.50 g，分別加入橙皮苷對照品溶液1 ml(每1 ml含橙皮苷0.3179 mg)，按照“2.3”項下的制備方法，制成加樣回收樣品溶液，再按照“2.1”項下的色譜條件測定，記錄峰面積，計算加樣回收率的平均值為100.28%，其相對標準偏差為0.50%。試驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明，該方法準確度良好。見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.7 樣品的測定取10批康骨寧顆粒各約1 g，按照“2.3”項下的方法制備樣品溶液，再按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算康骨寧顆粒中橙皮苷的平均含量為8.24 mg/袋。見表3。

表3 康骨寧顆粒中橙皮苷的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 指標性成分的選擇康骨寧顆粒由13味中藥組成，君藥龍血竭來源于百合科喬木植物劍葉龍血樹(Dracaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen)的含脂木材經(jīng)提取得到的樹脂，具有良好的活血散瘀、定痛止血和斂瘡生肌的作用[9]，素有“活血之圣藥”的美譽?，F(xiàn)代藥理研究[10,11]顯示龍血竭能明顯縮短小鼠凝血時間和家兔血漿復鈣時間，廣泛應用于跌打損傷、外傷出血等，可作為血竭的國產(chǎn)替代品。多省市頒布的中藥飲片炮制規(guī)范[9,12，13]中以龍血素B作為含量測定的成分，均使用三氯甲烷(非極性溶劑)作為成分提取溶劑。通過查閱相關(guān)研究資料[10，14-16]，僅對龍血竭的脂溶性成分(黃酮類、木質(zhì)素、皂苷類、甾醇類、酚類等)有相關(guān)研究。結(jié)合康骨寧顆粒的制備工藝，龍血竭脂溶性成分不適宜作為康骨寧顆粒的指標性成分。臣藥當歸中的水溶性阿魏酸與佐藥川芎的阿魏酸經(jīng)過試驗，存在陰性干擾。筆者對處方中其他藥材進行了研究，參考《中華人民共和國藥典》[6]和文獻報道[17]選擇了行氣藥陳皮中橙皮苷為指標性成分，建立了橙皮苷的含量測定方法。

3.2 樣品提取方法的選擇根據(jù)文獻報道[17，18]、橙皮苷的溶解性以及康骨寧顆粒的制備工藝等因素，對樣品中指標性成分橙皮苷提取溶劑的濃度(50%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇)、用量(25 ml、50 ml、75 ml、100 ml)和超聲提取時間(0.5 h、1 h、1.5 h、2 h)進行了考察與擇優(yōu)選擇。最終確定采用80%乙醇溶液25 ml進行提取，超聲處理30 min為提取的條件。應用該方法處理后的樣品，橙皮苷成分提取完全、提取率高，溶劑的用量處于最優(yōu)化，室溫下含橙皮苷的供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3 橙皮苷含量限定的確定據(jù)《中華人民共和國藥典》[6]陳皮項下規(guī)定：水分不得過13.0%，干燥品含橙皮苷(C28H34O15)不得少于2.5%?？倒菍庮w粒每袋中含有陳皮為1.44 g，在充分考慮大生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的藥材損耗等因素，橙皮苷的轉(zhuǎn)移率以12%為標準(制劑工藝研究橙皮苷轉(zhuǎn)移率為15%)，得出本品每袋含橙皮苷為3.76 mg。故擬將康骨寧顆粒的含量限度定為：每袋含陳皮的劑量，以橙皮苷(C28H34O15)計，不得少于3.8 mg。

此試驗以橙皮苷為指標性成分，利用HPLC法測定陳皮中橙皮苷的含量測定，并初步設(shè)定含量限定的標準。該方法樣品制備方法簡便，測量方法專屬性好，陰性無干擾，定量分析方法的精密度、重復性、穩(wěn)定性、準確度良好，可有效地控制該藥品的內(nèi)在質(zhì)量，為康骨寧顆粒的質(zhì)量控制及質(zhì)量標準的制定提供了科學依據(jù)。