王 拓，黃書丹

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，四川 南充 637000)

瘢痕是創(chuàng)傷愈合過程中的常見并發(fā)癥，常伴增生、瘙癢、攣縮、疼痛、色素沉著及關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等不良癥狀，不僅影響組織美觀，還會(huì)引起皮膚功能障礙等，對(duì)患者的身心健康造成極大的困擾[1-2]。目前，在口腔領(lǐng)域中部分患者常因種植手術(shù)、牙周手術(shù)、口腔黏膜病或頜面部腫瘤性疾病導(dǎo)致軟組織的缺損。創(chuàng)傷形成后，成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原蛋白過度合成及降解失衡、膠原纖維的不規(guī)則排列堆積，都會(huì)引起創(chuàng)面組織病理性纖維化，形成瘢痕組織[3]。因此，瘢痕組織的形成主要與膠原蛋白的合成有關(guān)。傳統(tǒng)的口腔黏膜組織缺損的修復(fù)方法包括直接牽拉縫合、鄰近黏膜瓣轉(zhuǎn)移覆蓋、血管吻合游離皮瓣移植、組織工程黏膜修復(fù)術(shù)、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)等，但具有需要增加手術(shù)區(qū)域、傷口預(yù)后效果不好、價(jià)格昂貴、有倫理顧慮及免疫原性等缺點(diǎn)[4-5]。改良型富血小板纖維(APRF)是由GHANAATI等[6]于 2014 年提出的第三代新型富血小板纖維蛋白，是由人體靜脈血變速離心獲得的一種血液提取物，其纖維蛋白微觀結(jié)構(gòu)及機(jī)械性能、細(xì)胞分布、生長(zhǎng)因子含量等均與富血小板纖維蛋白有所不同[7]。與富血小板纖維蛋白相比，APRF含有更高水平的血小板和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，APRF顯著刺激了骨膜細(xì)胞的增殖。目前，有一些臨床試驗(yàn)證實(shí)APRF能夠很好地促進(jìn)口腔軟組織缺損修復(fù)再生[8-9]。但是國(guó)內(nèi)外關(guān)于APRF在軟組織修復(fù)中對(duì)瘢痕組織的影響還少見報(bào)道。本研究通過建立兔硬腭區(qū)軟組織缺損模型，探討APRF對(duì)瘢痕的影響機(jī)制，為臨床上生物材料的選擇提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取30只健康雄性日本大耳白兔，體重2.0～2.5 kg，由四川省成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供飼養(yǎng)及管理，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(川)2019-189，按照動(dòng)物倫理學(xué)要求對(duì)動(dòng)物進(jìn)行各項(xiàng)處置。兔硬腭軟組織缺損模型的制備[10]，將其隨機(jī)分為兩組。(1)APRF組：將制備的自體APRF膜修剪縫合固定于傷口上；(2)空白對(duì)照組：創(chuàng)面不進(jìn)行任何處理，任其自然愈合。

1.1.2實(shí)驗(yàn)主要儀器 種植機(jī)：Surgic XT Plus(NSK公司，日本)；種植手機(jī)：Ti-SG20L(NSK公司，日本)；5.0 mm組織環(huán)切鉆(MCT公司，韓國(guó))；纖維蛋白成型處理工具盒(Process，法國(guó))；APRF真空無菌采血管(10 mL)等。

1.1.3兔硬腭軟組織缺損模型的建立[11]沿兔耳緣緩慢靜脈推注3%戊巴比妥鈉1 mL/kg進(jìn)行麻醉，兔呈仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上；常規(guī)消毒，鋪洞巾；兔頭部稍后仰，以充分暴露硬腭組織，術(shù)者持接有直徑為5 mm環(huán)切鉆的種植手機(jī)，于兔硬腭前部中份(前緣距上頜后排門齒2 mm，左右距硬腭黏膜邊緣2 mm)制備軟組織缺損，剝離并去除黏骨膜直至抵達(dá)骨面。

1.2方法

1.2.1觀察指標(biāo)

1.2.2大體觀察 通過形態(tài)學(xué)初步觀察兩組在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)(建模7、21、28 d)形成瘢痕的情況。

1.2.3Masson染色 在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)(建模3、7、14、21、28 d)每組處死3只動(dòng)物后常規(guī)制作病理切片，以Masson三色染色，然后采用BA200Digital數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于100×鏡下觀察，再于400×鏡下隨機(jī)選取不重疊的3個(gè)視野，以Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics公司，美國(guó))測(cè)定所采集的3個(gè)圖像的膠原纖維平均吸光度(A)。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 標(biāo)本切割后稱重，加入適量生理鹽水，采用標(biāo)本勻漿器充分勻漿后離心(2 000～3 000 r/min，10～15 min)，收集上清液，-80 ℃保存，待測(cè)。按照兔羥脯氨酸(Hyp)、PDGF和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(橫坐標(biāo)：A值；縱坐標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)物的濃度)，查出對(duì)應(yīng)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品的實(shí)際濃度，重復(fù)操作3次，取平均值，最后得到Hyp、PDGF、TGF-β1在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)(建模3、7、14、21、28 d)的實(shí)際濃度。

2 結(jié) 果

2.1大體觀察 術(shù)后7 d，APRF組膜愈合面積均可達(dá)原創(chuàng)面面積的1/2；空白對(duì)照組創(chuàng)面紅腫仍明顯，可見明顯組織凹陷缺損。術(shù)后21 d，APRF組創(chuàng)面黏膜色澤、質(zhì)地與正常黏膜一致，空白對(duì)照組還存在少量組織凹陷，瘢痕組織明顯。術(shù)后28 d，空白對(duì)照組未見組織凹陷,但可見明顯瘢痕組織，見圖1。

2.2Masson染色結(jié)果 膠原纖維呈藍(lán)色深染，肌纖維、纖維素、肌肉、細(xì)胞質(zhì)呈紅色，紅細(xì)胞呈橘紅色，胞核呈黑藍(lán)色。術(shù)后3 d，兩組膠原纖維的含量均很少。術(shù)后7 d，兩組膠原纖維迅速增多，此時(shí)膠原纖維均比較細(xì)小，排列不整齊。術(shù)后14 d，APRF組膠原纖維排列整齊、規(guī)則,空白對(duì)照組膠原纖維逐漸增多，排列仍然較紊亂。術(shù)后21 d，空白對(duì)照組膠原纖維持續(xù)增多，呈紊亂排列，APRF組膠原纖維呈減少趨勢(shì)。術(shù)后28 d，APRF組膠原纖維繼續(xù)減少，空白對(duì)照組形成大量膠原纖維，紊亂排列交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。見圖2。術(shù)后3 d，兩組膠原纖維平均A值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后7、14 d，APRF組膠原纖維平均A值大于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后21 d兩組膠原纖維平均A值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后28 d，APRF組膠原纖維平均A值小于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)膠原纖維平均A值比較

2.3ELISA

2.3.1Hyp定量分析 術(shù)后3、7、14 d，APRF組Hyp水平明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后21、28 d，兩組Hyp水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)Hyp水平比較

2.3.2PDGF 術(shù)后3 d，兩組PDGF水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后7 d，APRF組PDGF水平高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后14、21、28 d，兩組PDGF水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)PDGF水平比較

2.3.3TGF-β 術(shù)后3、7、14、28 d，APRF組TGF-β水平均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β水平比較

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，APRF組創(chuàng)面愈合明顯較空白對(duì)照組更快、更好，提示APRF膜可在一定程度上促進(jìn)創(chuàng)面愈合。成纖維細(xì)胞異常增殖及膠原蛋白過度合成是瘢痕組織的主要病理學(xué)特點(diǎn)[3]。膠原蛋白是結(jié)締組織的重要組成部分，如果膠原蛋白合成與降解失調(diào)，導(dǎo)致其過度沉積，將會(huì)引起創(chuàng)面組織病理性纖維化，形成瘢痕組織。創(chuàng)面愈合過程包括炎性反應(yīng)階段、肉芽形成階段、組織修復(fù)重塑3個(gè)階段，多種細(xì)胞及分子參與這個(gè)過程，其中生長(zhǎng)因子發(fā)揮重要作用[11]。APRF屬于新型的血液提取物，可起到支架作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，APRF具有比PRF更大、更疏松的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，更有利于組織細(xì)胞及各種生長(zhǎng)因子的遷徙和增殖[12]。創(chuàng)傷形成后，APRF中的血小板激活，釋放各種細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素(IL)，如IL-1和IL-4、PDGF、TGF-β、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、腫瘤壞死因子(TNF)等，這些生長(zhǎng)因子與軟組織的愈合密切相關(guān)。在創(chuàng)傷愈合早期，PDGF可誘導(dǎo)大量的纖維母細(xì)胞到創(chuàng)傷區(qū)，并促進(jìn)其更快地分化為成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞主要合成并分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白[13]。同時(shí)，成纖維細(xì)胞合成并分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)對(duì)此過程具有重要的調(diào)控作用。研究顯示，PDGF對(duì)MMPs合成及分泌具有重要的調(diào)控作用[14]。TGF-β也可促進(jìn)表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞遷移至創(chuàng)傷區(qū)。TGF-β也能雙重調(diào)控MMPs，從而調(diào)節(jié)膠原蛋白的合成與代謝[15]。TGF-β還可通過TGF-β/Smad 通路調(diào)控并啟動(dòng)成纖維細(xì)胞的增殖分裂，導(dǎo)致膠原蛋白的大量合成，并在細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，最終導(dǎo)致纖維化的組織病理學(xué)改變[16-17]。目前，有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smad信號(hào)通路異常傳導(dǎo)與增生性瘢痕形成密切相關(guān)[18]。說明在膠原纖維的合成與降解方面，PDGF和TGF-β是2種非常重要的生長(zhǎng)因子。Hyp是膠原蛋白的特征性表達(dá)成分，可以反映創(chuàng)面肉芽組織的形成情況，對(duì)創(chuàng)面愈合質(zhì)量的評(píng)估有重要意義[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過ELISA測(cè)定不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)Hyp、PDGF、TGF-β的實(shí)際濃度，并結(jié)合Masson染色的膠原纖維平均A值分析比較各組膠原蛋白合成與分解情況、膠原纖維形成的多少及排列情況。

從形態(tài)學(xué)方面觀察，APRF組在第14天左右已基本完成創(chuàng)面愈合，且基本沒有瘢痕存在，而空白對(duì)照組在28 d左右才基本完成創(chuàng)面愈合，存在明顯的瘢痕反應(yīng)。結(jié)合Masson染色結(jié)果分析：在創(chuàng)傷愈合早期(術(shù)后7 d內(nèi))，兩組膠原纖維形成較少，此時(shí)的Hyp水平也較少，推測(cè)此階段膠原蛋白的含量不能交聯(lián)排列成膠原纖維。在創(chuàng)傷愈合中期(術(shù)后7～15 d)，羥脯氨酸含量增加，APRF組合成膠原蛋白的能力增強(qiáng)，且膠原纖維排列整齊且規(guī)則，而空白對(duì)照組的膠原纖維也多，但排列紊亂。結(jié)合ELISA結(jié)果分析，此階段APRF組的PDGF、TGF-β水平較空白對(duì)照組均更高，推測(cè)PDGF、TGF-β具有促進(jìn)膠原蛋白之間的化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，加快形成膠原纖維的速度。PDGF、TGF-β水平到15 d左右達(dá)最大值，15 d以后呈下降趨勢(shì)。由此可推測(cè)PDGF和TGF-β的釋放峰值可能在14 d左右。在創(chuàng)傷愈合后期(術(shù)后21～28 d)，Masson染色結(jié)構(gòu)顯示，空白對(duì)照組的膠原纖維較多，排列紊亂，而APRF組的膠原纖維反而減少，APRF組的Hyp水平較之前明顯減少，較空白對(duì)照組均更少。而PDGF、TGF-β的水平也均較空白對(duì)照組更多，該結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是由于APRF中PDGF、TGF-β水平更高，導(dǎo)致膠原纖維降解的速度更快，膠原蛋白總的水平更少。而空白對(duì)照組因?yàn)槿鄙偕L(zhǎng)因子的作用，導(dǎo)致膠原纖維的降解不夠，最后形成纖維化瘢痕組織，與形態(tài)學(xué)的結(jié)果相符合。在創(chuàng)面愈合過程中，APRF能夠很好地減少軟組織瘢痕的形成，這為APRF在軟組織缺損修復(fù)領(lǐng)域中的推廣應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。但由于瘢痕增生過程非常復(fù)雜，可涉及多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其具體作用機(jī)制在后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)水平方面的深入研究。