秦淑國，許元元，趙萍萍，李慧慧，李振鵬

皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 宿州 234001

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae,Hi）屬于臨床常見的呼吸道感染細(xì)菌，主要通過呼吸道傳播并造成呼吸道或其他器官病變，多見于體質(zhì)較弱的兒童和老年人群，同時(shí)也是引起兒童社區(qū)獲得性肺炎的常見致病菌，因此，對Hi的準(zhǔn)確檢測對疾病的診斷、治療方案的制定以及預(yù)后的評估均具有重要意義[1-2]。然而，早期對Hi的鑒別主要依賴細(xì)菌培養(yǎng)，雖然結(jié)果較為準(zhǔn)確，但耗時(shí)較長，使得臨床診斷價(jià)值大打折扣；同時(shí)抗菌藥物濫用、疫苗使用、耐藥性增加等諸多因素也影響Hi檢測準(zhǔn)確性[3-4]。全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（MALDI-TOF）通過質(zhì)譜技術(shù)對Hi進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的判斷，其高效、簡便的操作優(yōu)勢獲得了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用[5-6]。為進(jìn)一步評價(jià)全自動(dòng)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)在鑒定Hi中的應(yīng)用價(jià)值，皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院開展了此次研究，現(xiàn)將相關(guān)內(nèi)容總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院2020年7 月至2021 年3 月痰培養(yǎng)標(biāo)本1 135 份，采用細(xì)菌16S rDNA 序列測序方法對標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌種屬鑒定。剔除同一患者重復(fù)分離的菌株后得到30 株Hi菌株。

1.2 方法

1.2.1 儀器設(shè)備與耗材 Bruker 質(zhì)譜儀及配套軟件（布魯克公司），三氟乙酸、標(biāo)準(zhǔn)溶劑（乙腈、水和三氟乙酸的比例分別為50%、47.5%和2.5%）、甲酸（Sigma-Aldrich 公司）；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀Vitek 2 Compact及配套NH鑒定卡片（梅里埃公司）；MH瓊脂及X因子、V因子、X+V因子紙片（Oxiod公司）。

1.2.2 檢測方法 依據(jù)《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》將待測標(biāo)本接種于Hi培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。分別采用MALDI-TOF、Vitek 及M-H 瓊脂藥敏試驗(yàn)對所有受檢標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌種屬鑒定，記錄并比較3種方法下Hi菌株的鑒定結(jié)果。

MALDI-TOF：選用Bruker 質(zhì)譜儀，選取待檢單個(gè)菌落涂于質(zhì)譜儀金屬靶板上，先后加入甲酸和適量基質(zhì)液，靜置干燥后放于質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測。

Vitek：采用常規(guī)生化反應(yīng)比色法進(jìn)行鑒定。

M-H瓊脂藥敏試驗(yàn)：依據(jù)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)范行X、V 因子需求試驗(yàn)，選取待測菌落制成0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙壕鶆蛲坎加贛-H瓊脂平板上，無菌操作取X、V 及X+V 因子試片進(jìn)行接種，最后放置于濃度為5%的CO2培育箱中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，24 h后判讀結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，檢出率的比較使用配對χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用xˉ±s表示；鑒定用時(shí)比較采用方差分析進(jìn)行總體比較，再使用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3 種方法對Hi菌株鑒定結(jié)果比較 30 株Hi，其中22 株3 種方法均可檢出，4 株由MALDI-TOF、Vitek鑒定出來，3株僅有MALDI-TOF鑒定出，另有1 株3 種方法均未檢出，具體鑒定結(jié)果見表1。MALDI-TOF 對Hi菌株的檢出率高達(dá)96.67%，其雖高于Vitek的86.67%，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.333，P=0.248）；Vitek與M-H瓊脂試驗(yàn)檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.250，P=0.134）；MALDI-TOF 對Hi菌株的檢出率明顯高于M-H瓊脂試驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.143，P=0.023）。

表1 3種檢測方法對Hi菌株鑒定結(jié)果比較

2.2 3 種方法對Hi菌株的鑒定用時(shí)比較 3 種方法中MALDI-TOF 對Hi菌株的檢測用時(shí)最短，為（0.15±0.01）h，其次是Vitek，為（17.04±5.93）h，M-H瓊脂試驗(yàn)用時(shí)最長，為（36.78±9.58）h。3 種方法用時(shí)總體存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.258，P＜0.001）。進(jìn)一步用LSD-t檢驗(yàn)做多重比較結(jié)果表明，3 種方法的用時(shí)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。

3 討論

Hi對體質(zhì)較弱的兒童和老年人具有較高的侵襲性，而兒童和老年人一旦感染后，容易對自身機(jī)體各系統(tǒng)造成不良影響，從而導(dǎo)致病程遷延，影響兒童的生長發(fā)育以及老人的生活質(zhì)量，因此，近年來Hi的鑒定隨著呼吸系統(tǒng)疾病的高發(fā)而受到廣泛關(guān)注[7]。臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，由于呼吸道內(nèi)正常菌群的存在和抗菌藥物濫用，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)受到了明顯干擾，影響診斷結(jié)果；此外不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、不同操作人員的主觀判斷能力也會導(dǎo)致診斷結(jié)果的差異[4]。因此尋求更為快捷、方便、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法成為臨床研究的熱點(diǎn)。

MALDI-TOF 及M-H 瓊脂試驗(yàn)均操作簡便，前者結(jié)果為自動(dòng)顯示，耗材成本最低，但需要特殊儀器，后者為肉眼判讀，耗材成本高于前者，不要特殊儀器；Vitek操作相對復(fù)雜，儀器自動(dòng)判讀結(jié)果，耗材成本最高。

MALDI-TOF 技術(shù)是根據(jù)細(xì)菌、真菌的特征性蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行微生物鑒定，通常只需要幾分鐘，大大縮短檢測時(shí)間，可實(shí)現(xiàn)微生物的快速鑒定，提高感染性疾病的診斷效率。此次研究結(jié)果顯示，與Vitek、M-H瓊脂試驗(yàn)的檢出率相比，MALDI-TOF對Hi菌株的檢出率最高。原因在于MALDI-TOF具有廣泛的檢測范圍，其自有的細(xì)菌數(shù)據(jù)庫包含了各類細(xì)菌的菌譜，能有效提高鑒別準(zhǔn)確率；而且通過配套軟件優(yōu)化繁瑣的工作流程，有效降低了人為因素造成的誤差，同時(shí)能夠滿足大樣本量、避免樣品交叉污染，大大提高了檢測效率和準(zhǔn)確性[8]。

研究中MALDI-TOF、Vitek對Hi的檢測用時(shí)均較M-H 瓊脂試驗(yàn)明顯縮短，說明MALDI-TOF、Vitek的效率更高[9-10]。雖然M-H瓊脂試驗(yàn)對檢測設(shè)備的要求低，但Hi對培養(yǎng)環(huán)境要求高，技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)和操作水平參差不齊，可能會導(dǎo)致該方法對Hi的檢出率低。此外，M-H 瓊脂試驗(yàn)操作步驟繁瑣、檢測時(shí)間較長，在此過程中Hi可能因傳代次數(shù)增加而導(dǎo)致最終的生化反應(yīng)結(jié)果不正確[11]。

綜上所述，全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)可對Hi進(jìn)行有效鑒定，其具有成本低、準(zhǔn)確率高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，在臨床Hi的鑒定中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。