李海平,王曉慧,謝 驥,張運良,李明娟

1.湖南邵陽中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,邵陽 422001;2.湖南邵陽學(xué)院藥學(xué)院,邵陽 422000

馬錢子為馬錢科植物馬錢（Strychnosnux-vomicaL.）的干燥成熟種子,具有通絡(luò)散結(jié)、消腫止痛的功效[1]。其有效成分為馬錢子總堿（主要為馬錢子堿和士的寧）。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究證明,馬錢子有鎮(zhèn)痛、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高免疫、抗腫瘤等作用[2],但因其安全范圍窄,限制了其在臨床上的使用。以脂質(zhì)體為載體的藥物易在角質(zhì)層內(nèi)形成藥物儲庫,藥物可持續(xù)地對病變細胞起到治療作用,極大地提高治療效果,減少全身不良反應(yīng)的發(fā)生[3-5]。同時,因其與皮膚角質(zhì)層的脂質(zhì)有高度的生物相容性,能在皮膚局部積累,起到持續(xù)地藥物釋放作用[6-7]。本研究用硫酸銨主動載藥技術(shù)制備馬錢子納米脂質(zhì)體（total alkaloids ofStrychnosnux-vomicaL.of nanoliposome,TAS-NL）并制成馬錢子總堿納米脂質(zhì)體凝膠（total alkaloids ofStrychnosnux-vomicaL.of nanoliposome gel,TAS-NL-Gel）,希望強化促滲劑效能以提高載藥量,并通過馬錢子堿緩慢、持續(xù)地釋放,起到減毒增效的作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1220 Serie高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）;78HW-1恒溫磁力加熱攪拌器（常州榮華儀器制造有限公司）;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;KQ-500B-超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）;H1850高速離心機（湖南湘儀儀器有限公司）;Zetasizer Nano ZSP納米粒度電位儀（富瑞博國際有限公司）;FEI透射電子顯微鏡（美國賽默飛世爾科技有限公司）;ZTY 智能透皮吸收實驗儀TP-2A（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 試藥

馬錢子粉[緬甸產(chǎn),原藥購于邵東廉橋,經(jīng)邵陽學(xué)院中藥教研室李成艦教授鑒定為馬錢科植物馬錢（Strychnosnux-vomicaL.）的干燥成熟種子,經(jīng)砂燙法炮制后去殼過40目篩];馬錢子堿對照品（批號110705-202006）、士的寧對照品（批號110706-202005）均購自中國食品藥品檢定研究院;庚烷磺酸鈉（色譜純,批號20200928,北京奧秘佳醫(yī)藥科技有限公司）;大豆卵磷脂[批號20200427,艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司];膽固醇[批號20191015,艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司];Sephadex G-50（批號20200511,上海源葉生物科技有限公司進口分裝）;水溶性氮酮（批號20200422,西安晉湘藥用輔料有限公司）;丙二醇（批號20200716,西安天正藥用輔料有限公司）;桉葉油（批號20200713,湖北康純香料有限公司）;其他試劑均為分析純或色譜純;水為超純水。

1.3 動物

清潔級KM 小鼠,雄性,體質(zhì)量為18～22 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 TAS-NL-Gel的制備

2.1.1 馬錢子總堿的制備 TAS 濃縮液為自制,其中馬錢子堿的質(zhì)量濃度為（20.06±0.03）mg·mL-1、士的寧的質(zhì)量濃度為（39.94±0.04）mg·mL-1。

2.1.2 TAS-NL-Gel的制備 采用硫酸銨主動載藥技術(shù)[7-8]制備TAS-NL,見圖1。最佳工藝參數(shù)為脂-藥比10∶1、磷脂-膽固醇比6∶1、硫酸銨溶液的質(zhì)量濃度0.2 mg·mL-1,乙醇的用量0.12 mL·g-1。

圖1 脂質(zhì)體制備流程Fig.1 Flow of preparation of brucine total alkali nanoliposomes

2.1.3 TAS-NL-Gel的制備 取TAS-NL（質(zhì)量濃度1 mg·mL-1）10 mL,加促滲劑適量,PBS 溶液（pH 6.0～6.8）4 mL,用三乙醇胺調(diào)pH 至6.0～6.8,0.01 mol·L-1鹽酸甲醇溶液加至50 g后與預(yù)先配制好的質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1的卡波姆940等量混合基質(zhì)（pH 6.0～6.8）50 g 混合均勻,即得到100 g TAS-NL-Gel（馬錢子堿的含量約為100μg·g-1、士的寧的含量約為200μg·g-1）。

2.1.4 TAS-Gel的制備 將2.1.3項下的TAS-NL換成TAS（質(zhì)量濃度1 mg·mL-1）10 mL,即得到100 g TAS-Gel（含馬錢子堿約100μg·g-1、士的寧約200μg·g-1）。

2.2 TAS-NL的質(zhì)量評價

采用納米粒度電位儀,以超純水為分散介質(zhì)測得馬錢子總堿脂質(zhì)體的Zeta電位為-36 m V、平均粒徑為（172±6.19）nm,結(jié)果見圖2。用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片,見圖3。由圖3 可見,TAS-NL呈球形,形態(tài)完整,分界清晰。

圖2 脂質(zhì)體粒徑分布Fig.2 Size distribution of liposomes

圖3 脂質(zhì)體掃描電鏡圖Fig.3 The scanning electron microscopic photograph of liposomes

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件 Hypersil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5μm）;流動相:流動相A（79%）為0.01 mol·mL-1的庚烷磺酸鈉和0.02 mol·mL-1磷酸二氫鈉等量混合,然后用100 mg·mL-1的磷酸鹽調(diào)pH=2.8,流動相B（21%）為乙腈;流速:1 mL·min-1;檢測波長:262 nm;進樣量:20μL;柱溫:30℃[9]。

2.3.2 供試液的制備 精密移取TAS濃縮液適量,用0.01 mol·mL-1甲醇溶液溶解后過濾,濾液稀釋至對照品溶液質(zhì)量濃度范圍內(nèi),262 nm 處進樣20μL,記錄峰面積S,折算成含量。

2.3.3 線性關(guān)系的確定 分別精密稱取馬錢子堿和士的寧對照品各4 mg,置于100 mL 量瓶中,加入甲醇定容,作為40μg·mL-1對照品儲備液備用。分別精密移取對照品儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,置于10mL量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為4、8、12、16、20、24μg·mL-1的對照品溶液。以甲醇溶液為空白,于262 nm 處,進樣20μL 檢測。以峰面積S為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度C（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)（x）,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合后分別得馬錢子堿的回歸方程為y=20 663x-3 742,R2=0.999 0,士的寧的線性回歸方程為y=40 073x-1 044,R2=0.999 4,質(zhì)量濃度范圍均為4～24μg·mL-1。

2.3.4 精密度實驗 分別取對照品溶液,連續(xù)進樣6次,每次20μL,記錄峰面積S。計算得馬錢子堿峰面積的RSD 值為0.87%（n=6）,士的寧峰面積的RSD值為0.78%（n=6）,表明該方法的精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性實驗 分別在0、2、4、8、12和24 h分別進樣TASS-NL-Gel供試品溶液20μL,記錄峰面積S。計算得馬錢子堿峰面積的RSD 值為1.21%（n=6）,士的寧峰面積的RSD 值為1.13%（n=6）,表明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性實驗 取同一批TAS-NL-Gel供試品6份,連續(xù)進樣6次,每次20μL,記錄峰面積S。計算得馬錢子堿峰面積的RSD 值為1.12%（n=6）,士的寧峰面積的RSD 值為0.93%（n=6）,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率 分別于質(zhì)量濃度為8.12 μg·mL-1的3份供試液中加入質(zhì)量濃度為4μg·mL-1（低質(zhì)量濃度）、8μg·mL-1（中質(zhì)量濃度）、12μg·mL-1（高質(zhì)量濃度）的對照品溶液,搖勻后分別進樣20μL,記錄峰面積S,每個樣品重復(fù)測定3次,得到馬錢子堿的平均回收率（n=3）為100.31%、100.56%、100.19%,平均RSD 值（n=3）為0.52%、0.48%、0.39%;士的寧的平均回收率為100.49%、99.89%、99.12%,平均RSD值（n=3）為0.24%、0.37、0.64%,表明該方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性良好。

2.3.8 凝膠的含量測定 取凝膠0.5 g,加甲醇10 mL,超聲攪拌3～5 min,高速（7 200 r·min-1）離心30 min,轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中定容。取上清液,經(jīng)無水硫酸鈉脫水后用0.45μm 微孔濾膜過濾。精密吸取濾液1 mL,用0.01 mg·mL-1的甲醇溶液稀釋至對照品溶液質(zhì)量濃度范圍內(nèi),262 nm 處進樣20μL,記錄峰面積S,折算成含量[10]。

2.3.9 體外透皮吸收實驗 采用改良的Franze擴散池,容積為6.3 mL,有效吸收面積為1 cm2。加入6 mL混合磷酸鹽緩沖液（pH 6.0～6.8）作為接收液,將處理好的離體小鼠腹皮與擴散池固定好,取1 g凝膠均勻涂抹于離體小鼠腹皮上,將擴散池置于（37±0.5）℃恒溫水浴槽中,在磁力攪拌器持續(xù)攪拌下,于0.5、1、2、4、8、12、24 h取出5.0 mL 接收液,同時補以同體積的空白接收液。將5.0 mL 接收液稀釋至對照品溶液質(zhì)量濃度范圍內(nèi),以PBS溶液（pH 6.0～6.8）為空白,262 nm 處進樣20μL,記錄峰面積S,計算相應(yīng)的藥物質(zhì)量濃度Cn,按以下公式計算單位面積累積釋藥量Q（μg·cm-2）[11]。

Cn為于第n個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度（μg·mL-1）;V為接收池的總體積（m L）,S為有效擴散面積（cm2）。

2.4 TAS-NL-Gel制劑處方的優(yōu)化

2.4.1 單因素分析實驗 選定載藥量（A）、促滲劑的品種（B）、促滲劑的用量（C）和氮酮-丙二醇-桉葉油的比例（D）4個影響因素進行單因素分析,在其他因素不變的情況下,改變?nèi)我灰蛩?通過5個水平的變化,考察各因素對馬錢子堿Q24的影響,以確定各因素的響應(yīng)點。因素-水平表見表1,各因素對馬錢子堿Q24的影響見圖4。

圖4 各因素對Q24 的影響（單因素）Fig.4 Influence of various factors on Q24（single factor）

表1 單因素分析的因素與水平Tab.1 Factors and levels of single factor analysis

結(jié)果顯示,載藥量為100μg·g-1、氮酮的質(zhì)量濃度為30 mg·mL-1、氮酮-丙二醇-桉葉油的比例為2∶2∶1時為最佳處方方案。載藥量達到100μg·g-1（臨床使用最低起效量）后,繼續(xù)增大載藥量,不能使Q24繼續(xù)升高,表明凝膠載藥具有一定的飽和性,釋藥具有劑量依賴性。

2.4.2 正交實驗設(shè)計 結(jié)合單因素分析結(jié)果確定氮酮的質(zhì)量濃度（A）、氮酮-丙二醇-桉葉油的比例（B）、載藥量（C）和方差（D）為考察因素,以馬錢子堿Q24為考察指標(biāo),用L9（34）正交實驗設(shè)計,因素-水平表見表2,正交實驗結(jié)果見表3,方差分析結(jié)果見表4。

表2 正交實驗設(shè)計的因素與水平Tab.2 Factors and levels of the orthogonal experimental design

表3 正交設(shè)計實驗結(jié)果Tab.3 Results of the orthogonal experimental design test

表4 正交實驗方差分析結(jié)果Tab.4 Analysis of variance in orthogonal experiment

直觀分析最優(yōu)處方方案為A3C1B2,主、次影響因素的順序為:C＞A＞B;方差分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果相符,主體間效應(yīng)檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此,在載藥量為100μg·g-1、氮酮的質(zhì)量濃度為30 mg·mL-1、氮酮-丙二醇-桉葉油的比例為2∶2∶1時為最佳處方方案,與實驗結(jié)果相符。

2.4.3 優(yōu)化處方驗證性實驗 按照最優(yōu)處方方案平行制備3份,Q24（馬錢子堿）為（85.16±0.19）μg·cm-2,RSD值為0.19%,Q24（士的寧）為（160.56±0.35）μg·cm-2,RSD值為0.44%,表明最優(yōu)處方方案穩(wěn)定、可靠、質(zhì)量可控。

2.5 TAS-NL-Gel體外滲透動力學(xué)考察

2.5.1 24 h單位面積累積滲透率（Q24）實驗 根據(jù)2.4.2 項下的方法,選用最優(yōu)處方方案分別制備TASS-NL-Gel和TASS-Gel,結(jié)果見表5。結(jié)果顯示,TAS-NL-Gel中馬錢子堿和士的寧的Q24均大于TAS-Gel,經(jīng)F檢驗,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 ASS-NL-Gel和TASS-Gel Q24Tab.5 ASS-NL-Gel and TAS-Gel Q24

2.5.2 皮膚滯留量（Qs）實驗 體外透皮吸收實驗結(jié)束后,用生理鹽水洗凈有效皮膚表面的藥物并盡量剪碎,加1 mL 甲醇,渦旋5 min,超聲30 min,以5 000 r·min-1離心10 min,上清液用0.45μm微孔濾膜過濾,取濾液按照含量測定的方法,每個樣品測定6次,分別記錄峰面積S并計算平均Qs,最后折算成單位面積皮膚滯留率（Qs）。

Qs=VC/A,A為有效擴散面積,V為溶解樣品的體積,C為測得的馬錢子堿和士的寧的質(zhì)量濃度。

結(jié)果顯示,馬錢子堿和士的寧脂質(zhì)體凝膠的皮膚滯留量分別為12.50和22.35μg·cm-2,馬錢子堿和士的寧普通凝膠的皮膚滯留量分別為8.04和14.67μg·cm-2,TAS-NL-Gel中馬錢子堿和士的寧的Qs大于TASS-Gel,經(jīng)F檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5.3 滲透動力學(xué)參數(shù)和方程擬合 將TAS-NLGel 24 h內(nèi)累積釋藥量（Q）和時間（t）的關(guān)系與零級釋放方程、Higuchi（滲透）方程,用OriginPro 9.0軟件擬合,滲透動力學(xué)方程的斜率即為穩(wěn)態(tài)滲透速率（Js）,擬合結(jié)果見表6,滲透動力學(xué)參數(shù)見表7。

表6 滲透動力學(xué)方程擬合結(jié)果Tab.6 Fitting results of osmotic dynamics equations

表7 滲透動力學(xué)參數(shù)Tab.7 Osmotic dynamic parameters

結(jié)果顯示,TASS-NL-Gel中馬錢子堿和士的寧的Js均大于TASS-Gel,經(jīng)F檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

本實驗采用硫酸銨主動載藥技術(shù)（課題組前期研究）制備了TAS-NL 并嘗試制成TAS-NL-Gel,從實驗結(jié)果來看,TAS-NL 的表征相對穩(wěn)定;TAS-NLGel的Q24均高于TAS-Gel,提示TAS-NL有助于凝膠的透皮吸收;TAS-NL-Gel的Qs均高于TAS-Gel,提示TAS-NL-Gel在皮膚中存在儲藥庫,這種皮膚儲庫效應(yīng),有利于藥物持續(xù)、緩慢地釋放,從而起到減毒增效的作用。

3.1 關(guān)于促滲劑

影響凝膠劑發(fā)揮作用的關(guān)鍵是藥物是否能夠按照需要順利地透過皮膚屏障,大部分研究者常常單獨使用某一種促滲劑（如氮酮）來促進藥物的滲透。氮酮主要是通過降低藥物向角質(zhì)層間隙中脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)移溫度,增大分子的流動性,減小藥物在角質(zhì)層中的擴散阻力,從而增加藥物的透過量[12],但由于氮酮的溶解性能差（脂溶性、水溶性均差）故使制成的制劑外觀受到一定影響（甚至有微顆粒感）,實驗結(jié)果顯示,氮酮的促滲效果與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),但與丙二醇聯(lián)用時會產(chǎn)生協(xié)同作用,最優(yōu)促滲質(zhì)量濃度為1～50 mg·mL-1,但當(dāng)質(zhì)量濃度超過40 mg·mL-1時,對皮膚的刺激性將影響制劑的長期使用[13];桉葉油的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,有優(yōu)良的脂溶性和水溶性,自身也具有祛風(fēng)除濕的作用。皮膚類脂層游離脂肪酸在適當(dāng)條件下可形成層狀液晶結(jié)構(gòu),桉葉油能滲透進入液晶結(jié)構(gòu)中,打亂甚至破壞液晶結(jié)構(gòu),但并不影響類脂分子本身的結(jié)構(gòu),這是桉葉油促進藥物經(jīng)皮吸收可能的原因之一[14]。

3.2 關(guān)于載藥量

凝膠的載藥量主要由凝膠基質(zhì)的性質(zhì)決定。介質(zhì)的pH 值、離子強度、藥物性質(zhì)等因素不同程度地影響卡波姆凝膠的載藥能力[14-15]?？ú?40 在pH 6.0～6.8時黏度適中,可使藥物呈零級或近似零級釋放的規(guī)律進行釋放[16]。馬錢子總堿為弱生物堿,相對分子質(zhì)量也比較大,載藥量的增大會使藥物難以進入網(wǎng)穴,本實驗試圖通過強化促滲劑效能提高載藥量,卻止步于100μg·g-1。表明凝膠的載藥具有一定的飽和性,釋藥具有劑量依賴性。

值得注意的是,本研究制備的TAS-NL-Gel中馬錢子堿和士的寧Q24的增大可能會導(dǎo)致體內(nèi)吸收量增加,故應(yīng)密切關(guān)注血藥濃度是否在治療窗內(nèi)。同時,提示需要對TAS-NL-Gel的劑量進行規(guī)范、準(zhǔn)確地分割,以免發(fā)生中毒反應(yīng)。皮膚儲庫效應(yīng)和促滲效應(yīng)會使TAS-NL-Gel體內(nèi)經(jīng)皮吸收呈現(xiàn)怎樣的變化,還需進一步開展在體內(nèi)經(jīng)皮吸收行為的研究,探索其在體內(nèi)準(zhǔn)確的釋放規(guī)律。