雷 雪,陳 碧,朱述陽

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,徐州 221000

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD）是常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病,以不完全可逆的氣流受限、氣道炎癥反應(yīng)持續(xù)激活為特征,目前尚缺乏逆轉(zhuǎn)氣流受限、抑制氣道炎癥的特效治療手段[1-2]。中醫(yī)理論認(rèn)為COPD 屬于“肺脹”“喘證”的范疇,病機(jī)復(fù)雜,如肺氣虧虛、痰瘀阻滯等均與COPD 的發(fā)病有關(guān)[3-4]。玉屏風(fēng)散是具有益氣固表、補(bǔ)虛理肺功效的中藥材,有研究報道應(yīng)用玉屏風(fēng)散治療由PM2.5所致肺損傷大鼠能夠改善其氣道功能、抑制炎癥反應(yīng)[5];變應(yīng)性鼻炎相關(guān)的研究則證實玉屏風(fēng)散抑制炎癥反應(yīng)的作用與其下調(diào)核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的表達(dá)水平有關(guān)[6-7]。本研究將玉屏風(fēng)散用于COPD 大鼠的治療,旨在闡明玉屏風(fēng)散治療COPD 的作用及機(jī)制,進(jìn)而為臨床治療COPD提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

顯微鏡（日本尼康公司）;動物肺功能儀（意大利科時邁公司）;凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

玉屏風(fēng)散水煎劑[中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）中藥房];陰性對照（NC）慢病毒及NF-κB慢病毒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）;HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）的酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司;NF-κB 及β-actin一抗均購自英國Abcam 公司。

1.3 動物

成年雄性SD 大鼠,許可證號SYXK（浙）2019-0003,購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 動物分組及干預(yù)

為研究玉屏風(fēng)散治療COPD 的價值,將成年雄性SD 大鼠隨機(jī)分為對照組、COPD 組、玉屏風(fēng)散組。對COPD 組、玉屏風(fēng)散組進(jìn)行COPD 造模。方法:第1、14天時分別麻醉大鼠,在胸骨上方1 cm 處切開氣管并注入脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）200μg;第2～13天、第15～28天時將大鼠放入吸煙箱內(nèi),每次燃燒10支香煙,持續(xù)約30 min,每日2次,2次間隔4～6 h。玉屏風(fēng)散組從第29天起進(jìn)行干預(yù),給予玉屏風(fēng)散1.98 g·kg-1灌胃,每日1次,連續(xù)處理14 d。

為研究NF-κB 在玉屏風(fēng)散治療COPD 中的作用,將成年雄性SD 大鼠隨機(jī)分為NC 慢病毒組、NC慢病毒+COPD 組、NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組、NF-κB慢病毒+玉屏風(fēng)散組。NC 慢病毒+COPD 組、NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組、NF-κB 慢病毒+玉屏風(fēng)散組于第1～28天時進(jìn)行COPD 造模;第29天時經(jīng)尾靜脈注射4.0×107TU·mL-1慢病毒載體50μL,給予玉屏風(fēng)散1.98 g·kg-1灌胃,1次/d,連續(xù)處理14 d。

2.2 肺功能檢測

末次給藥后24 h進(jìn)行肺功能檢測,麻醉后進(jìn)行氣管插管,連接肺功能儀和呼吸機(jī),設(shè)置潮氣量為10 mL·kg-1、呼吸頻率為60次·min-1,記錄自主呼吸狀態(tài)下的肺活量（forced vital capacity,FVC）、0.1 s呼氣量（forced expiratory volume 0.1,FEV0.1）、呼氣峰值流速（peak expiratory flow,PEF）。

2.3 肺組織病理改變檢測

完成肺功能檢測后處死大鼠,收集適量肺組織,以質(zhì)量濃度為40 mg·L-1的多聚甲醛固定后制做4μm 厚度的病理切片,用HE染色試劑盒進(jìn)行染色,染色后在顯微鏡下觀察肺組織的病理改變。

2.4 肺組織中TNF-α、IL-6含量的檢測

收集適量肺組織,加入組織裂解液后勻漿,離心收集上清,采用BCA 法試劑盒檢測蛋白濃度,采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測TNF-α、IL-6的含量,計算每毫克蛋白中TNF-α、IL-6的含量。

2.5 肺組織中NF-κB表達(dá)水平的檢測

收集適量肺組織,加入組織裂解液后勻漿,離心收集上清并加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium lauryl sulfate-polyacrylamide gel,SDSPAG）,電泳分離不同相對分子質(zhì)量的蛋白后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜,以質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜1 h,用1∶1 000稀釋的NF-κB一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗4℃孵育PVDF膜過夜,次日用1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育PVDF膜1 h,最后在凝膠成像儀中顯影得到NF-κB和β-actin,以β-actin的吸光度值為內(nèi)參,計算NF-κB的相對表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,實驗數(shù)據(jù)屬于計量資料,多組間比較采用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 玉屏風(fēng)散對COPD 大鼠肺功能的調(diào)節(jié)作用

與對照組比較,COPD 組大鼠的FVC、FEV0.1和PEF均顯著降低（P＜0.05）;與COPD 組比較,玉屏風(fēng)散組大鼠的FVC、FEV0.1和PEF 均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 3組大鼠FVC、FEV0.1和PEF的比較 （,n=8）Tab.1 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 3 groups（,n=8）

表1 3組大鼠FVC、FEV0.1和PEF的比較 （,n=8）Tab.1 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 3 groups（,n=8）

注:與對照組比較,*P＜0.05;與COPD 組比較,#P＜0.05。

3.2 玉屏風(fēng)散對COPD 大鼠肺組織病理改變的調(diào)節(jié)作用

對照組大鼠肺組織內(nèi)結(jié)構(gòu)正常;COPD 大鼠肺組織內(nèi)肺泡出現(xiàn)破裂,可見炎癥細(xì)胞浸潤;玉屏風(fēng)散組大鼠肺組織內(nèi)肺泡破裂、炎癥細(xì)胞浸潤較COPD 組改善。結(jié)果見圖1。

圖1 3組大鼠肺組織病理改變的比較（HE染色）Fig.1 Comparison of pathological changes of lung tissue among the 3 groups（HE staining）

3.3 玉屏風(fēng)散對COPD 大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量及NF-κB表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

與對照組比較,COPD 組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6 的含量及NF-κB 的表達(dá)水平均顯著上升（P＜0.05）;與COPD 組比較,玉屏風(fēng)散組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的含量及NF-κB 的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2、圖2。

圖2 3組大鼠肺組織中NF-κB表達(dá)水平的比較Fig.2 Comparison of NF-κB expression level in lung tissue among the 3 groups

表2 3組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量的比較 （,n=8）Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 3 groups （,n=8）

表2 3組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量的比較 （,n=8）Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 3 groups （,n=8）

注:與對照組比較,*P＜0.05;與COPD 組比較,#P＜0.05。

3.4 尾靜脈注射慢病毒過表達(dá)NF-κB的效果

與NC慢病毒組比較,NC慢病毒+COPD 組大鼠肺組織中NF-κB的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）;與NC慢病毒+COPD組比較,NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組大鼠肺組織中NF-κB的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）;與NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組比較,NF-κB慢病毒+玉屏風(fēng)散組大鼠肺組織中NF-κB 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 4組大鼠肺組織中NF-κB表達(dá)水平的比較Fig.3 Comparison of NF-κB expression level in lung tissue among the 4 groups

3.5 過表達(dá)NF-κB 對玉屏風(fēng)散調(diào)節(jié)COPD 大鼠肺功能的影響

與NC慢病毒組比較,NC慢病毒+COPD 組大鼠的FVC、FEV0.1和PEF均顯著降低（P＜0.05）;與NC慢病毒+COPD組比較,NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組大鼠的FVC、FEV0.1和PEF均顯著升高（P＜0.05）;與NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組比較,NF-κB慢病毒+玉屏風(fēng)散組的FVC、FEV0.1和PEF均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 4組大鼠FVC、FEV0.1、PEF的比較 （,n=8）Tab.3 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 4 groups（,n=8）

表3 4組大鼠FVC、FEV0.1、PEF的比較 （,n=8）Tab.3 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 4 groups（,n=8）

注:與NC慢病毒組比較,*P＜0.05;與NC 慢病毒+COPD組比較,#P ＜0.05;與NC 慢病毒+玉屏風(fēng)散組比較,&P＜0.05。

3.6 過表達(dá)NF-κB 對玉屏風(fēng)散調(diào)節(jié)COPD 大鼠肺組織病理改變的影響

NC慢病毒組大鼠肺組織的結(jié)構(gòu)正常;NC 慢病毒+COPD 組大鼠肺組織內(nèi)肺泡出現(xiàn)破裂、可見炎癥細(xì)胞浸潤;NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組大鼠肺組織內(nèi)肺泡破裂、炎癥細(xì)胞浸潤較NC 慢病毒+COPD 組改善;NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組大鼠肺組織的病理改變較NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組加重。結(jié)果見圖4。

圖4 4組大鼠肺組織病理改變的比較 （HE染色）Fig.4 Comparison of pathological changes of lung tissue among the 4 groups（HE staining）

3.7 過表達(dá)NF-κB 對玉屏風(fēng)散調(diào)節(jié)COPD 大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量的影響

與NC慢病毒組比較,NC慢病毒+COPD 組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的含量顯著上升（P＜0.05）;與NC慢病毒+COPD 組比較,NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6 的含量顯著降低（P＜0.05）;與NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組比較,NF-κB慢病毒+玉屏風(fēng)散組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的含量顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 4組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量的比較 （,n=8）Tab.4 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 4 groups （,n=8）

表4 4組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量的比較 （,n=8）Tab.4 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 4 groups （,n=8）

注:與NC慢病毒組比較,*P＜0.05;與NC慢病毒+COPD組比較,#P＜0.05;與NC慢病毒+玉屏風(fēng)散組比較,&P＜0.05。

4 討論

氣流受限、氣道炎癥反應(yīng)激活是COPD 的主要特征,LPS聯(lián)合香煙煙霧吸入是常用的COPD 造模方法[8],本研究采用該方法造模后進(jìn)行了肺功能及肺組織病理改變檢測,COPD 組大鼠肺組織出現(xiàn)了典型的COPD 病理改變且FVC、FEV0.1、PEF 均顯著降低,與既往文獻(xiàn)[8]中關(guān)于COPD 模型大鼠肺功能及肺組織病理改變的描述一致,表明COPD 造模成功。

本研究用COPD 模型大鼠探究治療COPD 的方法。近年,中藥方劑在呼吸系統(tǒng)慢性疾病治療中的價值受到越來越多的重視。玉屏風(fēng)散由生黃芪、防風(fēng)、炒白術(shù)組成,能夠針對COPD 的中醫(yī)病機(jī)發(fā)揮益氣固表、補(bǔ)虛理肺的作用。有Meta分析表明,玉屏風(fēng)散用于穩(wěn)定期COPD 的治療能夠改善肺功能[9];另有臨床研究表明,玉屏風(fēng)散用于支氣管哮喘的治療能夠起到舒張氣道、緩解哮喘的作用[10]。本研究用玉屏風(fēng)散治療COPD大鼠后,觀察到其肺組織的病理改變明顯改善且FVC、FEV0.1、PEF均顯著上升,表明玉屏風(fēng)散能夠顯著改善COPD大鼠的肺功能及肺組織病理改變,提示玉屏風(fēng)散具有治療COPD的作用。

氣道炎癥反應(yīng)的持續(xù)激活、炎癥細(xì)胞因子的大量釋放是與COPD 發(fā)病及病情發(fā)展密切相關(guān)的病理因素。TNF-α和IL-6是已知與COPD 發(fā)病密切相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子,有研究報道,COPD 患者血清中及COPD 大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的含量均顯著增加[11-14]。根據(jù)現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的結(jié)果,玉屏風(fēng)散對炎癥反應(yīng)具有抑制作用,變應(yīng)性鼻炎相關(guān)的動物實驗證實,玉屏風(fēng)散對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜內(nèi)TNF-α、IL-6的表達(dá)具有抑制作用[6-7];另有細(xì)胞實驗證實,黃芪和白術(shù)中的活性成分黃芪多肽及白術(shù)內(nèi)酯具有抑制炎癥反應(yīng)的作用[15-16]。本研究用玉屏風(fēng)散治療COPD 大鼠后檢測到其肺組織中TNF-α、IL-6的含量明顯降低,表明玉屏風(fēng)散對COPD 大鼠肺組織的炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

NF-κB是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,直接參與TNF-α、IL-6表達(dá)的調(diào)控,本研究證實COPD 大鼠肺組織中NF-κB 的表達(dá)水平明顯上升,與既往文獻(xiàn)[17-20]中關(guān)于COPD 發(fā)病過程中NF-κB表達(dá)水平升高的結(jié)果一致。玉屏風(fēng)散治療變應(yīng)性鼻炎的過程中對NF-κB 的表達(dá)具有抑制作用,本研究觀察到玉屏風(fēng)散治療COPD 大鼠能夠使肺組織中NF-κB的表達(dá)水平降低,表明玉屏風(fēng)散可能通過抑制NF-κB 表達(dá)的方式改善COPD 大鼠的肺功能并抑制炎癥反應(yīng)。為了進(jìn)一步闡明NF-κB在玉屏風(fēng)散治療COPD 中的作用,本研究通過尾靜脈注射慢病毒的方式過表達(dá)NF-κB,在過表達(dá)NF-κB后進(jìn)行玉屏風(fēng)散干預(yù),結(jié)果表明,玉屏風(fēng)散改善肺功能及肺組織病理改變、抑制炎癥反應(yīng)的作用減弱,表明玉屏風(fēng)散治療COPD 的作用與抑制NF-κB的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,玉屏風(fēng)散用于COPD 大鼠的治療能夠改善氣道功能、肺組織病理改變并抑制炎癥反應(yīng),抑制NF-κB是玉屏風(fēng)散發(fā)揮上述治療作用的分子機(jī)制,這為今后發(fā)現(xiàn)COPD 新的治療策略提供了實驗依據(jù)和思路。