陶豫東,田會(huì)君,李 云,羅曉英

1.河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院急診科,鄭州 450000;2.河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院消化科,鄭州450000

中藥紫蘇葉具有發(fā)表散寒、理氣和營(yíng)的功效,所含的多糖和黃酮類成分為其主要活性成分[1-3]。紫蘇葉多糖及紫蘇總黃酮具有較好的抗糖尿病作用,能夠降低糖尿病模型小鼠的血糖,改善其血脂水平,同時(shí)可通過抑制氧化應(yīng)激和抗炎改善2型糖尿病大鼠的肝臟損傷[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子蛋白1（silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1）可激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）信號(hào)通路,調(diào)節(jié)脂肪生成和肝臟脂質(zhì)沉積,參與酒精性肝病的進(jìn)程[5]。因此,本文主要研究紫蘇葉多糖對(duì)酒精性肝損傷（alcoholic liver disease,ALD）小鼠是否具有改善作用,并明確該作用是否與抗炎及SIRT1-AMPK 信號(hào)通路具有關(guān)聯(lián)性,初步闡明其具體的作用及機(jī)制,為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AU2700型全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀（日本奧林巴斯有限公司）;SW1022-ProfiBlot 48型全自動(dòng)蛋白印跡分析儀（美國(guó)Bioneer公司）;IX73型倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）。

1.2 試藥

紫蘇葉多糖由紫蘇葉藥材經(jīng)水提醇沉法、脫色、脫蛋白等步驟純化[4],用苯酚-硫酸法檢測(cè)紫蘇葉多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%。

白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白細(xì)胞介 素-6（interleukin-6,IL-6）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自伊艾博（武漢）科技股份有限公司;丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（super compound dismutase,SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、SREBP-1c一抗及GAPDH 抗體均購(gòu)自美國(guó)Abbiotec公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠40只,8～10周齡,體質(zhì)量18～25 g,動(dòng)物合格證號(hào)202010208,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2020-2-006,動(dòng)物批次號(hào)202010108,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 ALD 小鼠模型的建立和分組

40只雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、ALD 模型組、紫蘇葉多糖低劑量組、紫蘇葉多糖高劑量組,每組10只,全部操作經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。除空白對(duì)照組外,其余3 組均采用慢性乙醇灌胃法誘導(dǎo)ALD 小鼠模型[6]:ALD 模型組小鼠連續(xù)處理60 d,每日用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇（12 mL·kg-1·d-1）灌胃;紫蘇葉多糖低、高劑量組在經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇（12 mL·kg-1·d-1）灌胃2 h 后再分別用0.3、0.6 g·kg-1的紫蘇葉多糖灌胃;空白對(duì)照組則用等量的生理鹽水灌胃。在第61天處死以上各組小鼠,斷頭收集血清,分離肝臟左葉并浸泡于體積分?jǐn)?shù)為10%的中性福爾馬林中,其余部分凍存于-80℃冰箱內(nèi),用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 ALD 小鼠肝臟組織HE染色及油紅O 染色

按照參考文獻(xiàn)[7]中的方法進(jìn)行HE 染色:用體積分?jǐn)?shù)為4%甲醛溶液固定24 h,用二甲苯透明,用石蠟包埋,用蘇木素精及伊紅染色,用光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織病理學(xué)改變,并進(jìn)行圖像采集。

按照參考文獻(xiàn)[8]中的方法進(jìn)行油紅O 染色:將取得的肝臟左葉組織進(jìn)行橫切取材,制做油紅O 冰凍染色切片,在正置顯微鏡下觀察肝臟細(xì)胞脂肪變性情況并攝片,其中肝臟細(xì)胞中的脂肪小滴呈紅色、細(xì)胞核呈藍(lán)色、細(xì)胞間質(zhì)無色,依據(jù)視野中脂滴的分布及所占視野的面積比例進(jìn)行綜合評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:0分,染色脂滴稀少并呈散在分布;1分,染色脂滴占視野面積≤1/4;2分,1/4＜染色脂滴占視野面積≤1/2;3分:1/2＜染色脂滴占視野面積≤3/4;4分,3/4＜染色脂滴占視野面積≤1。

2.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

各組小鼠處死前收集血清,于4℃靜置20 min后,在4℃以2 000 r·min-1離心20 min,隨后吸取上清,分裝后保存于-80℃待測(cè)。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase,AST）、三酰甘油（total cholesterol,TG）、總膽固醇（total cholesterol,TC）及低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL）和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL）的含量[9]。

2.4 ALD 小鼠肝臟組織炎性因子檢測(cè)

分離上述各組小鼠肝臟組織,參考文獻(xiàn)[10]中的方法制備肝臟勻漿（在勻漿器中,按照肝臟質(zhì)量/體積為1∶9加入預(yù)冷生理鹽水,制備成肝臟組織勻漿）,在4℃以3 500 r·min-1離心20 min,隨后吸取上清,嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書操作,每孔中加入10μL樣品及40μL 樣本稀釋液,用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。

2.5 ALD 小鼠肝臟組織氧化應(yīng)激因子水平檢測(cè)

按照2.4項(xiàng)下的方法制備肝臟組織勻漿,并吸取組織上清液,按照試劑盒的說明書檢測(cè)肝臟組織中MDA、SOD 及GSH-Px的含量[11]。

2.6 ALD 小鼠肝臟組織SIRT1-AMPK 信號(hào)通路蛋白的測(cè)定

分離上述各組小鼠的肝臟組織,按照參考文獻(xiàn)[12]中的方法制備肝組織勻漿,使用RIPA 裂解液（RIPA Lysis Buffer）裂解后提取肝臟總蛋白,應(yīng)用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量,95℃水浴5 min,蛋白變性后用SDSPAGE膠進(jìn)行電泳,濕法轉(zhuǎn)膜,置于脫脂牛奶中室溫封閉1 h后,依次加入用封閉液稀釋的兔源單克隆AMPKα（1∶1 000）、p-AMPKα（1∶1 000）、SREBP1c（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）和SIRT1（1∶1 000）一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗二抗（1∶2 000）,用化學(xué)底物發(fā)光法顯色,圖像掃描分析,采用Image-QuaNT 軟件檢測(cè)其吸光度,以各GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示,多組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA 檢驗(yàn),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紫蘇葉多糖對(duì)ALD小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

各組小鼠肝臟組織病理學(xué)結(jié)果如圖1所示,空白對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰完整,未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),可見稀少脂滴存在;ALD 模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)形態(tài)不完整,如圖1中紅色箭頭所示,細(xì)胞質(zhì)分界不清,細(xì)胞核碎裂明顯,嗜酸性明顯增強(qiáng),可見較多的肝細(xì)胞脂肪變性,如圖1中黑色箭頭所示,可見較多大小不一的脂肪空泡,如圖1中黃色箭頭所示,ALD 模型組小鼠的肝組織還存在輕度出血,如圖1中綠色箭頭所示,肝細(xì)胞內(nèi)廣泛存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn);紫蘇葉多糖低、高劑量組小鼠肝細(xì)胞損傷情況較ALD 模型組明顯改善,結(jié)構(gòu)比較完整,未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和出血,但可見肝細(xì)胞內(nèi)存在脂肪變性,但較ALD 模型組明顯減輕。

圖1 各組小鼠肝臟組織HE染色結(jié)果 （×200）Fig.1 HE staining of liver tissue of mice in each group （×200）

3.2 紫蘇葉多糖對(duì)ALD 小鼠肝臟組織脂肪變性的影響

各組小鼠肝臟組織油紅O 染色結(jié)果如圖2 所示,ALD 模型組小鼠肝臟脂滴的數(shù)量較空白對(duì)照組明顯增多,紫蘇葉多糖低、高劑量組肝臟脂質(zhì)沉積情況得以明顯改善。

圖2 各組小鼠肝臟油紅O 染色結(jié)果 （×200）Fig.2 Oil Red O staining of liver in each group of mice（×200）

各組小鼠肝臟組織脂肪變性情況比較見表1。由表1可見,與空白對(duì)照組比較,ALD 模型組小鼠肝臟脂肪細(xì)胞變性評(píng)分明顯升高（P＜0.05）;與ALD 模型組比較,紫蘇葉多糖低、高劑量組小鼠肝臟脂肪細(xì)胞變性評(píng)分顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組小鼠肝臟組織脂肪變性情況比較 （,n=10）Tab.1 Comparison of the fatty degeneration of the liver tissues of mice among groups （,n=10）

表1 各組小鼠肝臟組織脂肪變性情況比較 （,n=10）Tab.1 Comparison of the fatty degeneration of the liver tissues of mice among groups （,n=10）

注:與空白對(duì)照組比較,a P ＜0.05;與ALD 模型組比較,b P＜0.05;與紫蘇葉多糖低劑量組比較,c P＜0.05。

3.3 紫蘇葉多糖對(duì)ALD 小鼠血清生化指標(biāo)的影響

各組小鼠血清生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果見表2。與空白對(duì)照組比較,ALD 模型組小鼠血清中ALT、AST、TG、TC、LDL的水平均顯著升高（P＜0.05）,HDL的水平顯著降低（P＜0.05）。與ALD 模型組比較,紫蘇葉多糖低、高劑量組ALT、AST、TG、TC、LDL的水平均顯著降低（P＜0.05）,HDL 的水平顯著上升（P＜0.05）。紫蘇葉多糖低、高劑量組相比,上述指標(biāo)的差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠血清生化指標(biāo)的比較 （,n=10）Tab.2 Comparison of serum biochemical indexes of mice among groups （,n=10）

表2 各組小鼠血清生化指標(biāo)的比較 （,n=10）Tab.2 Comparison of serum biochemical indexes of mice among groups （,n=10）

注:與空白對(duì)照組比較,a P＜0.05,aa P＜0.01;與ALD 模型組比較,b P＜0.05;與紫蘇葉多糖低劑量組比較,c P＜0.05。

3.4 紫蘇葉多糖對(duì)ALD小鼠肝組織炎性因子的影響

各組小鼠肝組織中炎癥因子水平的檢測(cè)結(jié)果見表3。與空白對(duì)照組比較,ALD模型組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α的水平均顯著升高（P＜0.05）。與ALD模型組比較,紫蘇葉多糖低、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α的水平均顯著降低（P＜0.05）。紫蘇葉多糖低、高劑量組間上述指標(biāo)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠肝組織中炎癥因子水平的比較（,n=10）Tab.3 Comparison of the levels of inflammatory factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

表3 各組小鼠肝組織中炎癥因子水平的比較（,n=10）Tab.3 Comparison of the levels of inflammatory factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

注:與空白對(duì)照組比較,a P＜0.05,aa P＜0.01;與ALD模型組比較,b P＜0.05,bb P＜0.01;與紫蘇葉多糖低劑量組比較,c P＜0.05。

3.5 紫蘇葉多糖對(duì)ALD 小鼠肝組織氧化應(yīng)激因子水平的影響

各組小鼠肝組織中氧化應(yīng)激因子水平的檢測(cè)結(jié)果見表4。與空白對(duì)照組比較,ALD 模型組小鼠肝組織中MDA 的含量顯著升高（P＜0.01）,SOD 和GSH-Px的含量均顯著降低（P＜0.01）。與ALD 模型組比較,紫蘇葉多糖低、高劑量組MDA 的含量顯著降低（P＜0.01）,SOD 和GSH-Px的含量均顯著升高（P＜0.01）。紫蘇葉多糖低、高劑量組間上述指標(biāo)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組小鼠肝組織中氧化應(yīng)激因子水平的比較 （,n=10）Tab.4 Comparison of the levels of oxidative stress factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

表4 各組小鼠肝組織中氧化應(yīng)激因子水平的比較 （,n=10）Tab.4 Comparison of the levels of oxidative stress factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

注:與空白對(duì)照組比較,a P＜0.05,aa P＜0.01;與ALD模型組比較,b P＜0.05,bb P＜0.01;與紫蘇葉多糖低劑量組比較,c P＜0.05。

3.6 紫蘇葉多糖對(duì)ALD 小鼠肝組織中SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、SREBP1c蛋白表達(dá)量的影響

各組小鼠肝組織中各蛋白的表達(dá)量見圖3。與空白對(duì)照組比較,ALD 模型組小鼠肝組織中SREBP1c的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）,SIRT1和p-AMPKα/AMPKα的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。與ALD 模型組比較,紫蘇葉多糖低、高劑量組SREBP1c的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）,SIRT1和p-AMPKα/AMPKα的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）,SREBP1c 和p-AMPKα/AMPKα的相對(duì)表達(dá)量在紫蘇葉多糖低、高劑量組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠肝組織中SIRT1、AMPKα、p-AMPKα 和SREBP1c蛋白表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Graphical representation of SIRT1,AMPKα,p-AMPKαand SREBP1c protein expression in liver tissues of mice in each group

4 討論

紫蘇作為藥食同源的中草藥,具有抗菌消炎和抗氧化作用,其多種活性成分被應(yīng)用于心血管疾病及增加免疫力藥物的研發(fā)[13]。紫蘇葉多糖作為其主要多糖類活性成分能加快機(jī)體清除疲勞代謝物的速度,延緩疲勞的發(fā)生。紫蘇葉多糖具有較好的抗糖尿病作用,在降低血糖的同時(shí)可通過抑制氧化應(yīng)激、抗炎等發(fā)揮改善2型糖尿病大鼠肝損傷和調(diào)節(jié)糖尿病模型小鼠血脂代謝紊亂的作用[14]。在應(yīng)用紫蘇葉多糖后,可明顯降低糖尿病模型小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、LDL-C 的水平。在本研究中,紫蘇葉多糖能明顯改善ALD 模型組小鼠的肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、出血和脂肪變性,降低肝臟脂肪細(xì)胞評(píng)分,血清中ALT、AST、TG、TC、LDL 的含量均顯著降低,HDL水平顯著升高,說明紫蘇葉多糖對(duì)緩解酒精誘導(dǎo)的肝損傷、脂肪變性及血脂代謝紊亂同樣具有較好的療效。

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在ALD 及并發(fā)癥的進(jìn)展中具有重要作用[15]。長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激水平明顯升高,其終產(chǎn)物MDA 大量形成而耗竭體內(nèi)的SOD、GSH-Px等抗氧化物酶,過多的自由基產(chǎn)物致使肝臟的炎性物質(zhì)大量釋放,進(jìn)而促進(jìn)肝炎、肝硬化乃至肝癌的發(fā)生[16-17],因此,對(duì)于ALD,保肝、抗炎、抗氧化是治療的關(guān)鍵。在本研究中,紫蘇葉多糖明顯降低ALD模型組小鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA的含量,而SOD和GSH-Px的含量明顯上升,表明紫蘇葉多糖能提高ALD模型組小鼠肝臟的抗氧化活性,減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物和炎性物質(zhì)的生成量,提示其改善ALD模型小鼠肝損傷和血脂代謝紊亂的作用與抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)有關(guān)。

SIRT1可由肝臟表達(dá),參與糖脂代謝和炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié),SIRT1 可調(diào)控下游分子AMPK,參與抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)過程,肝臟的AMPK 可通過磷酸化作用激活其下游蛋白激酶SREBP-1c分子,參與肝臟的脂質(zhì)合成與代謝[18-19]。研究顯示,肝內(nèi)SIRT1的過表達(dá)可有效抑制因酒精引起的脂質(zhì)代謝紊亂[20]。在本研究中,ALD 小鼠肝組織中SIRT1的表達(dá)量及AMPKα的磷酸化水平均顯著降低,SREBP1c的相對(duì)表達(dá)量明顯升高,表明在ALD 小鼠體內(nèi)SIRT1-AMPK 信號(hào)通路受到抑制;在經(jīng)紫蘇葉多糖干預(yù)后,SIRT1 和p-AMPKα/AMPKα的相對(duì)表達(dá)量均顯著上升,SREBP1c的相對(duì)表達(dá)量顯著降低,表明紫蘇葉多糖可能通過激活SIRT1-AMPK 通路,減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成與代謝的關(guān)鍵調(diào)控分子,抑制脂肪酸合成,從而在緩解ALD 中發(fā)揮作用。

綜上所述,紫蘇葉多糖能改善ALD 模型小鼠因酒精引起的脂肪變性損傷和炎癥水平,對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與活化SIRT1/AMPK 信號(hào)通路有關(guān)。