陶豫東,田會君,李 云,羅曉英

1.河南省人民醫(yī)院/鄭州大學人民醫(yī)院急診科,鄭州 450000;2.河南省人民醫(yī)院/鄭州大學人民醫(yī)院消化科,鄭州450000

中藥紫蘇葉具有發(fā)表散寒、理氣和營的功效,所含的多糖和黃酮類成分為其主要活性成分[1-3]。紫蘇葉多糖及紫蘇總黃酮具有較好的抗糖尿病作用,能夠降低糖尿病模型小鼠的血糖,改善其血脂水平,同時可通過抑制氧化應激和抗炎改善2型糖尿病大鼠的肝臟損傷[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子蛋白1（silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1）可激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）信號通路,調(diào)節(jié)脂肪生成和肝臟脂質(zhì)沉積,參與酒精性肝病的進程[5]。因此,本文主要研究紫蘇葉多糖對酒精性肝損傷（alcoholic liver disease,ALD）小鼠是否具有改善作用,并明確該作用是否與抗炎及SIRT1-AMPK 信號通路具有關聯(lián)性,初步闡明其具體的作用及機制,為其臨床應用奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AU2700型全自動生物化學分析儀（日本奧林巴斯有限公司）;SW1022-ProfiBlot 48型全自動蛋白印跡分析儀（美國Bioneer公司）;IX73型倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）。

1.2 試藥

紫蘇葉多糖由紫蘇葉藥材經(jīng)水提醇沉法、脫色、脫蛋白等步驟純化[4],用苯酚-硫酸法檢測紫蘇葉多糖的質(zhì)量分數(shù)為75%。

白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白細胞介 素-6（interleukin-6,IL-6）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）檢測試劑盒均購自伊艾博（武漢）科技股份有限公司;丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（super compound dismutase,SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、SREBP-1c一抗及GAPDH 抗體均購自美國Abbiotec公司。

1.3 動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠40只,8～10周齡,體質(zhì)量18～25 g,動物合格證號202010208,動物許可證號SCXK（京）2020-2-006,動物批次號202010108,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2 方法

2.1 ALD 小鼠模型的建立和分組

40只雄性C57BL/6J小鼠適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為4組:空白對照組、ALD 模型組、紫蘇葉多糖低劑量組、紫蘇葉多糖高劑量組,每組10只,全部操作經(jīng)實驗動物管理委員會批準。除空白對照組外,其余3 組均采用慢性乙醇灌胃法誘導ALD 小鼠模型[6]:ALD 模型組小鼠連續(xù)處理60 d,每日用體積分數(shù)為50%的乙醇（12 mL·kg-1·d-1）灌胃;紫蘇葉多糖低、高劑量組在經(jīng)體積分數(shù)為50%的乙醇（12 mL·kg-1·d-1）灌胃2 h 后再分別用0.3、0.6 g·kg-1的紫蘇葉多糖灌胃;空白對照組則用等量的生理鹽水灌胃。在第61天處死以上各組小鼠,斷頭收集血清,分離肝臟左葉并浸泡于體積分數(shù)為10%的中性福爾馬林中,其余部分凍存于-80℃冰箱內(nèi),用于后續(xù)實驗。

2.2 ALD 小鼠肝臟組織HE染色及油紅O 染色

按照參考文獻[7]中的方法進行HE 染色:用體積分數(shù)為4%甲醛溶液固定24 h,用二甲苯透明,用石蠟包埋,用蘇木素精及伊紅染色,用光學顯微鏡觀察肝臟組織病理學改變,并進行圖像采集。

按照參考文獻[8]中的方法進行油紅O 染色:將取得的肝臟左葉組織進行橫切取材,制做油紅O 冰凍染色切片,在正置顯微鏡下觀察肝臟細胞脂肪變性情況并攝片,其中肝臟細胞中的脂肪小滴呈紅色、細胞核呈藍色、細胞間質(zhì)無色,依據(jù)視野中脂滴的分布及所占視野的面積比例進行綜合評分。評分標準為:0分,染色脂滴稀少并呈散在分布;1分,染色脂滴占視野面積≤1/4;2分,1/4＜染色脂滴占視野面積≤1/2;3分:1/2＜染色脂滴占視野面積≤3/4;4分,3/4＜染色脂滴占視野面積≤1。

2.3 血清生化指標檢測

各組小鼠處死前收集血清,于4℃靜置20 min后,在4℃以2 000 r·min-1離心20 min,隨后吸取上清,分裝后保存于-80℃待測。用全自動生化分析儀檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase,AST）、三酰甘油（total cholesterol,TG）、總膽固醇（total cholesterol,TC）及低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL）和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL）的含量[9]。

2.4 ALD 小鼠肝臟組織炎性因子檢測

分離上述各組小鼠肝臟組織,參考文獻[10]中的方法制備肝臟勻漿（在勻漿器中,按照肝臟質(zhì)量/體積為1∶9加入預冷生理鹽水,制備成肝臟組織勻漿）,在4℃以3 500 r·min-1離心20 min,隨后吸取上清,嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作,每孔中加入10μL樣品及40μL 樣本稀釋液,用酶標儀檢測450 nm處的吸光度并按照標準曲線計算樣品中IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。

2.5 ALD 小鼠肝臟組織氧化應激因子水平檢測

按照2.4項下的方法制備肝臟組織勻漿,并吸取組織上清液,按照試劑盒的說明書檢測肝臟組織中MDA、SOD 及GSH-Px的含量[11]。

2.6 ALD 小鼠肝臟組織SIRT1-AMPK 信號通路蛋白的測定

分離上述各組小鼠的肝臟組織,按照參考文獻[12]中的方法制備肝組織勻漿,使用RIPA 裂解液（RIPA Lysis Buffer）裂解后提取肝臟總蛋白,應用BCA 試劑盒進行蛋白定量,95℃水浴5 min,蛋白變性后用SDSPAGE膠進行電泳,濕法轉(zhuǎn)膜,置于脫脂牛奶中室溫封閉1 h后,依次加入用封閉液稀釋的兔源單克隆AMPKα（1∶1 000）、p-AMPKα（1∶1 000）、SREBP1c（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）和SIRT1（1∶1 000）一抗,辣根過氧化物酶標記的兔抗二抗（1∶2 000）,用化學底物發(fā)光法顯色,圖像掃描分析,采用Image-QuaNT 軟件檢測其吸光度,以各GAPDH 為內(nèi)參進行分析。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料用均數(shù)±標準差（）表示,多組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA 檢驗,兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 紫蘇葉多糖對ALD小鼠肝臟組織病理學的影響

各組小鼠肝臟組織病理學結果如圖1所示,空白對照組小鼠肝組織結構清晰完整,未見炎性細胞浸潤,可見稀少脂滴存在;ALD 模型組小鼠肝組織結構形態(tài)不完整,如圖1中紅色箭頭所示,細胞質(zhì)分界不清,細胞核碎裂明顯,嗜酸性明顯增強,可見較多的肝細胞脂肪變性,如圖1中黑色箭頭所示,可見較多大小不一的脂肪空泡,如圖1中黃色箭頭所示,ALD 模型組小鼠的肝組織還存在輕度出血,如圖1中綠色箭頭所示,肝細胞內(nèi)廣泛存在炎性細胞浸潤;紫蘇葉多糖低、高劑量組小鼠肝細胞損傷情況較ALD 模型組明顯改善,結構比較完整,未見明顯炎性細胞浸潤和出血,但可見肝細胞內(nèi)存在脂肪變性,但較ALD 模型組明顯減輕。

圖1 各組小鼠肝臟組織HE染色結果 （×200）Fig.1 HE staining of liver tissue of mice in each group （×200）

3.2 紫蘇葉多糖對ALD 小鼠肝臟組織脂肪變性的影響

各組小鼠肝臟組織油紅O 染色結果如圖2 所示,ALD 模型組小鼠肝臟脂滴的數(shù)量較空白對照組明顯增多,紫蘇葉多糖低、高劑量組肝臟脂質(zhì)沉積情況得以明顯改善。

圖2 各組小鼠肝臟油紅O 染色結果 （×200）Fig.2 Oil Red O staining of liver in each group of mice（×200）

各組小鼠肝臟組織脂肪變性情況比較見表1。由表1可見,與空白對照組比較,ALD 模型組小鼠肝臟脂肪細胞變性評分明顯升高（P＜0.05）;與ALD 模型組比較,紫蘇葉多糖低、高劑量組小鼠肝臟脂肪細胞變性評分顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組小鼠肝臟組織脂肪變性情況比較 （,n=10）Tab.1 Comparison of the fatty degeneration of the liver tissues of mice among groups （,n=10）

表1 各組小鼠肝臟組織脂肪變性情況比較 （,n=10）Tab.1 Comparison of the fatty degeneration of the liver tissues of mice among groups （,n=10）

注:與空白對照組比較,a P ＜0.05;與ALD 模型組比較,b P＜0.05;與紫蘇葉多糖低劑量組比較,c P＜0.05。

3.3 紫蘇葉多糖對ALD 小鼠血清生化指標的影響

各組小鼠血清生化指標的檢測結果見表2。與空白對照組比較,ALD 模型組小鼠血清中ALT、AST、TG、TC、LDL的水平均顯著升高（P＜0.05）,HDL的水平顯著降低（P＜0.05）。與ALD 模型組比較,紫蘇葉多糖低、高劑量組ALT、AST、TG、TC、LDL的水平均顯著降低（P＜0.05）,HDL 的水平顯著上升（P＜0.05）。紫蘇葉多糖低、高劑量組相比,上述指標的差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠血清生化指標的比較 （,n=10）Tab.2 Comparison of serum biochemical indexes of mice among groups （,n=10）

表2 各組小鼠血清生化指標的比較 （,n=10）Tab.2 Comparison of serum biochemical indexes of mice among groups （,n=10）

注:與空白對照組比較,a P＜0.05,aa P＜0.01;與ALD 模型組比較,b P＜0.05;與紫蘇葉多糖低劑量組比較,c P＜0.05。

3.4 紫蘇葉多糖對ALD小鼠肝組織炎性因子的影響

各組小鼠肝組織中炎癥因子水平的檢測結果見表3。與空白對照組比較,ALD模型組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α的水平均顯著升高（P＜0.05）。與ALD模型組比較,紫蘇葉多糖低、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α的水平均顯著降低（P＜0.05）。紫蘇葉多糖低、高劑量組間上述指標的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠肝組織中炎癥因子水平的比較（,n=10）Tab.3 Comparison of the levels of inflammatory factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

表3 各組小鼠肝組織中炎癥因子水平的比較（,n=10）Tab.3 Comparison of the levels of inflammatory factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

注:與空白對照組比較,a P＜0.05,aa P＜0.01;與ALD模型組比較,b P＜0.05,bb P＜0.01;與紫蘇葉多糖低劑量組比較,c P＜0.05。

3.5 紫蘇葉多糖對ALD 小鼠肝組織氧化應激因子水平的影響

各組小鼠肝組織中氧化應激因子水平的檢測結果見表4。與空白對照組比較,ALD 模型組小鼠肝組織中MDA 的含量顯著升高（P＜0.01）,SOD 和GSH-Px的含量均顯著降低（P＜0.01）。與ALD 模型組比較,紫蘇葉多糖低、高劑量組MDA 的含量顯著降低（P＜0.01）,SOD 和GSH-Px的含量均顯著升高（P＜0.01）。紫蘇葉多糖低、高劑量組間上述指標的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 各組小鼠肝組織中氧化應激因子水平的比較 （,n=10）Tab.4 Comparison of the levels of oxidative stress factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

表4 各組小鼠肝組織中氧化應激因子水平的比較 （,n=10）Tab.4 Comparison of the levels of oxidative stress factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

注:與空白對照組比較,a P＜0.05,aa P＜0.01;與ALD模型組比較,b P＜0.05,bb P＜0.01;與紫蘇葉多糖低劑量組比較,c P＜0.05。

3.6 紫蘇葉多糖對ALD 小鼠肝組織中SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、SREBP1c蛋白表達量的影響

各組小鼠肝組織中各蛋白的表達量見圖3。與空白對照組比較,ALD 模型組小鼠肝組織中SREBP1c的相對表達量顯著升高（P＜0.05）,SIRT1和p-AMPKα/AMPKα的相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。與ALD 模型組比較,紫蘇葉多糖低、高劑量組SREBP1c的相對表達量顯著降低（P＜0.05）,SIRT1和p-AMPKα/AMPKα的相對表達量均顯著升高（P＜0.05）,SREBP1c 和p-AMPKα/AMPKα的相對表達量在紫蘇葉多糖低、高劑量組間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠肝組織中SIRT1、AMPKα、p-AMPKα 和SREBP1c蛋白表達量的檢測結果Fig.3 Graphical representation of SIRT1,AMPKα,p-AMPKαand SREBP1c protein expression in liver tissues of mice in each group

4 討論

紫蘇作為藥食同源的中草藥,具有抗菌消炎和抗氧化作用,其多種活性成分被應用于心血管疾病及增加免疫力藥物的研發(fā)[13]。紫蘇葉多糖作為其主要多糖類活性成分能加快機體清除疲勞代謝物的速度,延緩疲勞的發(fā)生。紫蘇葉多糖具有較好的抗糖尿病作用,在降低血糖的同時可通過抑制氧化應激、抗炎等發(fā)揮改善2型糖尿病大鼠肝損傷和調(diào)節(jié)糖尿病模型小鼠血脂代謝紊亂的作用[14]。在應用紫蘇葉多糖后,可明顯降低糖尿病模型小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、LDL-C 的水平。在本研究中,紫蘇葉多糖能明顯改善ALD 模型組小鼠的肝組織炎性細胞浸潤、出血和脂肪變性,降低肝臟脂肪細胞評分,血清中ALT、AST、TG、TC、LDL 的含量均顯著降低,HDL水平顯著升高,說明紫蘇葉多糖對緩解酒精誘導的肝損傷、脂肪變性及血脂代謝紊亂同樣具有較好的療效。

氧化應激和炎癥反應在ALD 及并發(fā)癥的進展中具有重要作用[15]。長期飲酒導致肝臟氧化應激水平明顯升高,其終產(chǎn)物MDA 大量形成而耗竭體內(nèi)的SOD、GSH-Px等抗氧化物酶,過多的自由基產(chǎn)物致使肝臟的炎性物質(zhì)大量釋放,進而促進肝炎、肝硬化乃至肝癌的發(fā)生[16-17],因此,對于ALD,保肝、抗炎、抗氧化是治療的關鍵。在本研究中,紫蘇葉多糖明顯降低ALD模型組小鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA的含量,而SOD和GSH-Px的含量明顯上升,表明紫蘇葉多糖能提高ALD模型組小鼠肝臟的抗氧化活性,減少氧化應激產(chǎn)物和炎性物質(zhì)的生成量,提示其改善ALD模型小鼠肝損傷和血脂代謝紊亂的作用與抑制氧化應激及炎癥反應有關。

SIRT1可由肝臟表達,參與糖脂代謝和炎性反應的調(diào)節(jié),SIRT1 可調(diào)控下游分子AMPK,參與抗炎、抗氧化應激等多種生物學過程,肝臟的AMPK 可通過磷酸化作用激活其下游蛋白激酶SREBP-1c分子,參與肝臟的脂質(zhì)合成與代謝[18-19]。研究顯示,肝內(nèi)SIRT1的過表達可有效抑制因酒精引起的脂質(zhì)代謝紊亂[20]。在本研究中,ALD 小鼠肝組織中SIRT1的表達量及AMPKα的磷酸化水平均顯著降低,SREBP1c的相對表達量明顯升高,表明在ALD 小鼠體內(nèi)SIRT1-AMPK 信號通路受到抑制;在經(jīng)紫蘇葉多糖干預后,SIRT1 和p-AMPKα/AMPKα的相對表達量均顯著上升,SREBP1c的相對表達量顯著降低,表明紫蘇葉多糖可能通過激活SIRT1-AMPK 通路,減輕體內(nèi)氧化應激和炎癥反應,調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成與代謝的關鍵調(diào)控分子,抑制脂肪酸合成,從而在緩解ALD 中發(fā)揮作用。

綜上所述,紫蘇葉多糖能改善ALD 模型小鼠因酒精引起的脂肪變性損傷和炎癥水平,對肝臟具有一定的保護作用,其機制可能與活化SIRT1/AMPK 信號通路有關。