高 豐,陳 瑩,戴子琦,郭慧娟,吳倩文,陳紅珊,亓金釵,李 桐,陳可點,王亞欣,崔鶴蓉,王鵬龍,杜 菁*,徐 冰*,雷海民*

1.北京中醫(yī)藥大學,北京 102488;2.北京同仁堂科技發(fā)展有限公司,北京 100062

由SARS-Co V-2病毒引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 19,COVID-19）對人類健康及經濟構成嚴重威脅。其臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、乏力,繼而可發(fā)展為呼吸衰竭、膿毒血癥等直接危及患者生命[1]。

中醫(yī)認為COVID-19 屬疫病范疇,主要是由于寒濕疫毒之邪從口鼻而入,寒濕邪氣侵襲肺臟所致[2],在臨床治療中清肺排毒湯、宣肺敗毒方等傳統(tǒng)方劑具有很好的療效。防風通圣丸原方出自《黃帝素問宣明論方》,被列入國家衛(wèi)生健康委員會和國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》（試行第5版）,由麻黃、荊芥穗、防風、薄荷、大黃、芒硝、滑石、梔子、石膏、黃芩、連翹、桔梗、當歸、白芍、川芎、白術（炒）和甘草組成,具有解表通里、清熱解毒的功效,臨床常用于蕁麻疹、哮喘、肺炎和感冒的治療。

本研究用網絡藥理學及分子對接技術挖掘防風通圣丸中的有效成分、潛在作用靶點及作用機制,以期為臨床治療COVID-19提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 防風通圣丸中主要成分及靶標蛋白的篩選

用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及在線分析平臺（traditional Chinese medicine system pharmacology database and online analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php）收集防風、荊芥穗、薄荷、麻黃、大黃、梔子、桔梗、川芎、當歸、黃芩、連翹、甘草、白芍和白術的主要活性成分。以口服利用度（oral bioavailability,OB）值≥30%和類藥性（drug-likeness,DL）值≥0.18為篩選條件,篩選出候選的活性成分。為避免個別認可度較高的有效成分被剔除,通過查閱《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）（2020版）得到此類成分并合并至TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選結果中,同時獲取化合物對應的靶標蛋白,在TCMSP 未查詢到成分的靶標蛋白應用Swisstarget（http://swisstargetprediction.ch/）進行預測。

1.2 靶標蛋白基因名的確定

在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中查找所有靶標的基因名,并將查詢到的靶標蛋白名稱轉化為相應的基因簡稱。

1.3 COVID-19相關靶標的獲取

在Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中以“novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞進行搜索,收集得到與COVID-19相關的作用靶點。應用Venny 平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將防風通圣丸有效成分的靶標蛋白與COVID-19的疾病靶點進行映射,得到防風通圣丸治療COVID-19的交集靶點。

1.4 藥物-靶點-疾病交互網絡的建立

將防風通圣丸藥物、活性成分、交集靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2軟件中,構建防風通圣丸藥物-靶點-疾病交互網絡,對其進行拓撲分析后以節(jié)點連接度（Degree）及介度（Betweenness）≥2 倍中位數(shù)且緊密度（Closeness）≥1倍中位數(shù)為篩選條件,得到活性成分及有效靶點。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建

將1.4 項下得到的有效靶點導入String 平臺（https://string-db.org/）,限定物種為“Homo sapiens”,將篩選后的結果保存為“TSV”格式,導入Cytoscape 3.7.2軟件,構建蛋白-蛋白相互作用網絡。

1.6 KEGG 和GO富集分析

對得到的有效靶點利用DAVID 平臺（https://david.ncifcrf.gov/）進行GO 和KEGG 富集分析,分析靶點涉及的基因功能及相應的信號通路,并利用R語言將其可視化。

1.7 分子對接

選擇藥物-靶點-疾病網絡中篩選出的有效成分與COVID-19 關鍵靶點SARS-Co V-2 3CL 水解酶[3]、血管緊張素轉換酶Ⅱ（ACE2）[4]進行分子對接,并將目前臨床用于治療COVID-19的化學藥利巴韋林、利托那韋、洛匹那韋、磷酸氯喹和阿比多爾作為陽性對照。首先,從RCSB 蛋白結構數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）中獲得SARS-Co V-2 3CL水解酶（PDB ID:6LU7）和ACE2（PDB ID:1R42）的三維結構,導入AutoDock 4.2.6進行除水等操作,保存為“PDBQT”格式。從Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載化合物結構“sdf”文件,采用Chem3D 軟件將其轉化為“mol2”文件,保存為“PDBQT”格式。將經過前處理的配體和目的靶點導入AutoDock 4.2.6軟件進行格點能計算后,進行分子對接。本研究以結合能≤-5.0 kJ·mol-1為分子與靶點結合性較好[5]。

2 結果

2.1 收集和篩選得到的防風通圣丸主要成分和靶點

用TCMSP數(shù)據(jù)庫以OB≥30%和DL≥0.18為條件檢索得到防風通圣丸化學成分224種。用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集得到224種化學成分對應靶點共696個。其中存在1種活性成分對應多個靶點及1個靶點對應多種活性成分的情況。

2.2 COVID-19疾病靶點和防風通圣丸治療COVID-19的潛在靶點

利用GeneCards平臺檢索得到COVID-19疾病靶點259個,通過Venny平臺將防風通圣丸主要成分所對應的靶點與COVID-19 疾病靶點取交集,得到79個防風通圣丸治療COVID-19的潛在靶點。

2.3 藥物-靶點-疾病交互網絡的構建與分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件構建的藥物-靶點-疾病交互網絡,見圖1。圖中共有264個節(jié)點及1 046條邊。Degree值反映了網絡中節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)量,Betweenness是網絡中所有最短路徑中經過該節(jié)點的路徑數(shù)量與最短路徑總數(shù)之比,Degree與Betweenness是衡量一個節(jié)點在網絡中重要性的主要拓撲參數(shù)。由圖1可見,1種成分可對多個靶點起作用,同時也存在多種成分對1 個靶點起作用的情況,表明防風通圣丸具有多成分、多靶點相互協(xié)同治療COVID-19的特點。

圖1 藥物-靶點-疾病交互網絡Fig.1 Network of drug-target-disease

2.4 活性成分及有效靶點的獲得

利用Cytoscape 3.7.2軟件對藥物-靶點-疾病交互網絡進行拓撲分析,并以Degree值及Betweenness值≥2倍中位數(shù)且Closeness值≥1倍中位數(shù)為標準,篩選出活性成分10 種,以黃酮類化合物為主,排名前5的化合物分別為槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇和柚皮素;有效靶點23 個,PTGS2、PTGS1、NOS2、F10 和DPP4 為排名前5的靶點。結果見表1、表2。

表1 防風通圣丸的主要活性成分Tab.1 Main active components of Fangfeng Tongsheng Pills

表2 防風通圣丸的主要有效靶點Tab.2 Main effective targets of Fangfeng Tongsheng Pills

2.5 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建與分析

通過String平臺構建蛋白-蛋白相互作用網絡,見圖2。由圖2可見,共有22個節(jié)點（F10為孤立靶點,未參與分析）,150條邊。其中節(jié)點表示蛋白,節(jié)點越大表示度值越大,連線越粗表明其評分越高,即關系越密切,顏色的深淺與度值及介值呈正相關。網絡中蛋白平均節(jié)點度值為13.63,有15個節(jié)點度值超過平均值。TP53、MAPK3、CASP3、TNF 和IL-6的度值較大,為顏色最亮的5個節(jié)點,提示其可能是防風通圣丸治療COVID-19的主要作用靶點。

圖2 蛋白-蛋白相互作用網絡Fig.2 Protein-protein interaction network

2.6 GO 富集分析

經GO 富集分析,共得到65條富集結果。主要涉及炎癥反應（inflammtory response）等方面。結果見圖3。

圖3 防風通圣丸活性成分作用靶點的GO 基因功能富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of effect targets of compounds from Fangfeng Tongsheng Pills

2.7 KEGG 富集分析

經KEGG 富集分析后,得到101條富集結果,包括TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、VEGF 信號通路（VEGF signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（toll-like receptor signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）。本研究選出KEGG 富集分析中排名前25的項目,見圖4。排序越靠前,提示其越可能是防風通圣丸治療COVID-19的主要作用機制。

圖4 防風通圣丸作用靶點KEGG 信號通路富集分析的25條通路Fig.4 KEGG enrichment analysis of 25 pathways of effect targets of Fangfeng Tongsheng Pills

2.8 分子對接

血管緊張素轉換酶Ⅱ（angiotensin converting enzyme 2,ACE2）是SARS-Co V-2的宿主細胞受體,并且SARS-Co V-2是通過其棘突S蛋白與人體細胞表面的ACE2受體結合,從而導致病毒侵入機體而致病[6]。控制新型冠狀病毒復制復合物活性的主水解酶Mpro在病毒生命周期中有重要作用,Mpro與小核糖核酸病毒3C 水解酶具有相似的切割位點特異性,此酶通常稱為SARS-Co V-2 3CL水解酶[7]。目前,多數(shù)研究者認為,配體與受體在結合構象穩(wěn)定的情況下,能量越低表明此受體與配體發(fā)生作用的可能性越大。將防風通圣丸的10 種有效成分分別與SARS-Co V-2 3CL水解酶（PDB ID:6LU7）和ACE2（PDB ID:1R42）進行分子對接,結果見表3,防風通圣丸中10 種成分與SARS-Co V-2 3CL 水解酶和ACE2的結合能均小于-5.0 kJ·mol-1。其中以β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚與SARS-Co V-2 3CL水解酶和ACE2靶點結合能最低,并與陽性對照藥物最接近。

表3 防風通圣丸核心化合物及臨床治療藥物與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2的結合親合能Tab.3 Binding affinities of key compounds in Fangfeng Tongsheng Pills and clinical drugs with SARS-Co V-2 3CL hydrolase and ACE2

3 討論

網絡藥理學建立在疾病-基因-靶點-藥物相互作用網絡的基礎上,其可用于分析藥物或方劑中多成分-多靶點-多途徑的復雜作用網絡,可體現(xiàn)出中醫(yī)理論中多成分、多靶點協(xié)同治療的特點。分子對接技術是利用計算機模式識別和優(yōu)化技術,計算物理化學參數(shù),從而評價配體、受體二者間的相互作用,進而達到輔助藥物篩選的目的,現(xiàn)已廣泛用于基于特定靶標的中藥及復方活性成分篩選的研究[8-10]。

基于網絡藥理學分析結果,得出防風通圣丸中治療COVID-19的潛在活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇和柚皮素等;作用靶點為TP53、MAPK3、CASP3、TNF和IL-6等。前期大量的研究表明,槲皮素具有抗炎、抗病毒的作用,其可通過調控Toll樣受體（TLR7）通路,減少IL-6和TNF-α等炎性因子的分泌,從而減輕支氣管上皮細胞的炎癥并對呼吸道病毒感染起抑制作用[11]。IL-6為機體內參與信息傳遞及調節(jié)激活免疫細胞的一種細胞因子,IL-6的表達失調會導致多種疾病的發(fā)生。同時,IL-6 是引發(fā)炎癥風暴的關鍵細胞因子,阻斷IL-6與其受體的結合可以抑制炎癥風暴[12]。木犀草素除可抑制IL-6和TNF-α等細胞因子的表達外[13],還可調節(jié)MAPK 信號轉導途徑中的多個靶標,通過抑制IL-1β誘導的激酶活化而對MAPK 轉導途徑產生影響,從而發(fā)揮抗炎作用[14]。MAPK3 與MAPK1 同屬于MAPK 家族成員,其可誘導產生促炎反應,其在氧化應激和病毒感染等環(huán)境中會被激活。β-谷甾醇的作用機制與木犀草素類似,可通過減少NO 的合成,抑制巨噬細胞IL-6的活性,減少IL-1和TNF-α等炎性因子的分泌[15]。TNF 主要由巨噬細胞和T 淋巴細胞產生,TNF-α可通過活化中性粒細胞及相關炎性因子、影響肺表面活性物質以及肺內皮細胞等機制造成急性肺損傷[16]。山柰酚通過抑制新型冠狀病毒3a通道蛋白從而抑制病毒的釋放[17]。IL-10屬細胞因子中的干擾素家族,可以激活巨噬細胞,并能在轉錄水平上強烈抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的合成。柚皮素可通過下調Toll樣受體（TLR2和TLR4）,顯著抑制IL-10水平的上升,從而抑制由沙眼衣原體引起的炎癥反應[18]。

GO 富集結果主要涉及炎癥和氧化應激通路。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn),防風通圣丸治療COVID-19可能與TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路、Toll樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路及MAPK 信號通路有關。TNF 可促進促炎因子的表達,參與全身炎癥反應[19],亦有抗感染效應,可阻止病毒早期蛋白質的合成,進而抑制病毒復制和殺傷被病毒感染的細胞[20]。HIF-1由HIP-1α和HIF-1β2種亞基構成,是缺氧應激的關鍵因子,是氧穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)劑。HIF-1通路與病毒性肺炎的炎癥因子釋放有關[21]。且HIP-1α表達的上調可導致肺部阻塞性疾病的發(fā)展[22]。VEGF 通路與炎癥抑制、減輕肺損傷有關。COVID-19會導致患者嚴重缺氧,而缺氧對VEGF 基因的表達有重大影響[23]。Toll樣受體是先天性免疫系統(tǒng)中的細胞跨膜受體和病原膜識別受體之一,其常介導各種炎癥細胞因子的產生,參與肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展[24]。PI3K-Akt信號通路對于呼吸道疾病及肺部炎癥的治療具有重要意義[25]。MAPK 通路與病毒性肺炎有關[26],細胞因子和生長因子等的刺激會激活MAPK 通路,促進免疫細胞成熟、活化和分化,并促進炎性細胞因子的合成、釋放,參與炎癥免疫反應[27]。

防風通圣丸方藥中將防風、麻黃、荊芥穗和薄荷4種藥材合用,可發(fā)汗解表,使外邪從汗而解,故為君藥。君藥中的活性成分β-谷甾醇、柚皮素、槲皮素、木犀草素、山柰酚、金合歡素、和蘆薈大黃素可作用于TNF、HIF-1、NOS、PI3K-Akt、MAPK、VEGF 及Toll樣受體通路中的TNF、RELA、MAPK1、MAPK3、F10、NOS2、PGTF2、IL-6和PGTS2等靶點發(fā)揮抗炎、調節(jié)免疫、抗病毒、抑制病毒釋放和抗缺氧的作用。大黃、芒硝、滑石、梔子、石膏、黃芩、連翹和桔梗8味藥共為臣藥,可清熱瀉火、解毒散結。臣藥中的活性成分大黃素、漢黃芩素、黃芩素、金合歡素、槲皮素、木犀草素和β-谷甾醇可調節(jié)TNF、HIF-1、VEGF、MAPK、PI3K-Akt和Toll樣受體通路中的TNF、IL-6、CXCL8、MAPK14、NOS2、RELA、PTGS2和PIK3CG 等靶點起到抗炎、抗病毒、調節(jié)免疫和抗缺氧的作用。

為了進一步確定防風通圣丸抗COVID-19的藥效物質基礎,本研究采用分子對接技術對防風通圣丸活性成分進行對接驗證。由分子對接結果可知,防風通圣丸中的10 種有效成分與SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2蛋白的結合能均小于-5.0 kJ·mol-1。其中β-谷甾醇、甘草查耳酮、山柰酚與SARS-Co V-2 3CL 水解酶的結合能甚至低于臨床推薦使用的3CLpro抑制劑洛匹那韋,即該類化合物可能與3CLpro 直接結合,阻斷病毒的增殖。槲皮素、木犀草素、山柰酚和柚皮素與ACE2的結合能較低,可能直接作用于人體細胞,阻斷病毒的侵入。上述結論在一定程度上證實了網絡藥理學成分篩選的結果,表明防風通圣丸中的β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素、山柰酚和柚皮素等可能為潛在的抗COVID-19的活性成分。

綜上所述,本文用網絡藥理學及分子對接技術分析防風通圣丸治療COVID-19 的作用機制,結果表明防風通圣丸中的β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素等活性成分可與SARS-Co V-2 3CL 水解酶、ACE2 結合,通過多靶點的方式調節(jié)TNF、HIM-1和VEGF等多條通路,發(fā)揮抗炎、抗病毒和抗缺氧等作用,從而獲得治療COVID-19的效果,這為其臨床應用提供了理論基礎。