鄧岳，梁麗靜，遲原龍，孫群

(1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610064；3.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064)

醬油作為中國(guó)使用大豆為主要原料的傳統(tǒng)的發(fā)酵制品之一，因其獨(dú)特營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與風(fēng)味品質(zhì)而備受全球人民尤其是亞洲人民的喜愛，中國(guó)作為最早釀造醬油的國(guó)家之一，其釀造歷史可以追溯到周朝時(shí)期[1]。傳統(tǒng)醬油釀造過程中主要包括以曲霉發(fā)酵代謝活動(dòng)為中心的制曲階段和以耐鹽性乳酸菌和耐鹽性酵母菌為中心的固液發(fā)酵階段，并且醬油中的重要特征風(fēng)味物質(zhì)，如乙醇、甘油和醇類物質(zhì)以及芳香族化合物都在此階段生成，從而賦予醬油特殊的風(fēng)味特征。在醬油固液發(fā)酵過程中，以耐鹽性乳酸菌和耐鹽性酵母菌為主的微生物對(duì)醬油色、香、味和體態(tài)的形成和品質(zhì)起重要作用[2]。

目前，國(guó)內(nèi)醬油釀造行業(yè)中工業(yè)生產(chǎn)醬油主要采用滬釀3.042作為發(fā)酵的工業(yè)菌種[3]，該菌種具有產(chǎn)酶能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、抵抗污染能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但添加單一菌種制曲生產(chǎn)的醬油風(fēng)味和口感遠(yuǎn)不如傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油。傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油采用的是長(zhǎng)周期開放式的釀造工藝，醬醅發(fā)酵過程涉及到多種有益微生物的聯(lián)合協(xié)同作用，通過微生物分解原料中的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等大分子化合物產(chǎn)生醇類、醛類、酸類、酯類、酚類等小分子風(fēng)味物質(zhì)，是醬油獨(dú)特產(chǎn)品風(fēng)味形成的主要途徑[4]。因此，研究傳統(tǒng)發(fā)酵醬油中微生物多樣性對(duì)揭示醬油品質(zhì)形成顯得尤為必要。

四川省瀘州市先市鎮(zhèn)的先市醬油，采用手工作坊式的天然多菌種混合發(fā)酵工藝，在自然環(huán)境中日曬夜露3～5年，所產(chǎn)醬油具有獨(dú)特風(fēng)味和顯著的區(qū)域特色[5]。該釀造技藝于2014年被列入中國(guó)“非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”名錄進(jìn)行重點(diǎn)保護(hù)，其生產(chǎn)場(chǎng)所也被列為“四川重點(diǎn)文物保護(hù)單位”名錄。本文擬對(duì)先市醬油釀造技藝過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為揭示傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，傳統(tǒng)自然發(fā)酵釀造技藝調(diào)整，解釋傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油風(fēng)味等品質(zhì)形成和潛力菌株篩選提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

1.1 樣品采集

樣品：由四川省瀘州市合江縣先市釀造食品有限公司提供，分別采自整個(gè)發(fā)酵過程中的第0.5，1，2，3，4年，具體取樣點(diǎn)和樣品命名見圖1。每個(gè)年份由3個(gè)隨機(jī)分布的醬缸中間位置取樣，樣品選擇遵循隨機(jī)原則，不同醬缸樣品經(jīng)充分混合后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 先市醬油生產(chǎn)工藝流程和試驗(yàn)樣品取樣點(diǎn)Fig.1 The production process of Xianshi soy sauce and sampling points of test samples

1.2 主要試劑

FastPfu聚合酶：TransGen Biotech Co., Ltd.；2%瓊脂糖凝膠：Biowest公司；DNA抽提試劑盒(Omega-soil DNA kit)：Omega公司；Illumina MiSeq平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；其余試劑：均為分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備

NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì) Thermo Fisher Scientific公司；ABI GeneAmp?9700型PCR儀；ABSON MiFly-6小型離心機(jī)；Eppendorf 5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；DYY-6C電泳儀；Illumina MiSeq測(cè)序儀；BioTek ELx800酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.4 DNA 抽提和 PCR 擴(kuò)增

采用 E.Z.N.A.?soil DNA kit (Omega BioTek, Norcross, GA, U.S.)提供的標(biāo)準(zhǔn)DNA提取方法，對(duì)傳統(tǒng)工藝發(fā)酵醬油中微生物群落總DNA進(jìn)行抽提，并使用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并使用NanoDrop 2000對(duì)提取的測(cè)定DNA濃度和純度進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.5 PCR擴(kuò)增

以傳統(tǒng)工藝發(fā)酵醬油中提取的基因組DNA作為模板，對(duì)該基因組的16S rDNA序列V3-V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，使用的引物如下：

338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；

806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

DNA擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 3 min，27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)，72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，并置于4 ℃保存，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。

1.6 Illumina MiSeq測(cè)序

將傳統(tǒng)發(fā)酵醬油中同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后，進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收與純化、檢測(cè)定量后，使用Illumina公司的MiSeq PE300/NovaSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用fastp[6]、FLASH[7]、UPARSE[8]等分析軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并基于分類學(xué)信息，討論傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中提取的基因組DNA作為模板，用通用引物對(duì)其16S rDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的目的片段見圖2。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoretogram of PCR amplified products注：M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為發(fā)酵6個(gè)月；2為發(fā)酵1年；3為發(fā)酵2年；4為發(fā)酵3年；5為發(fā)酵4年。

由圖2擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖可知，條帶清晰，可以滿足后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)要求。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中擴(kuò)增DNA樣本，經(jīng)Illumina MiSeq高通量測(cè)序、質(zhì)控并優(yōu)化后共得到212762 條有效序列，且每組的有效序列數(shù)均在37000以上，占比80%以上，表明本次測(cè)序達(dá)到傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中后續(xù)微生物多樣性分析的要求。

2.3 α多樣性分析

根據(jù)傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中97%相似性水平下的OTU信息，對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中的微生物物種豐富度和多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果見表1，在本次傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中樣本測(cè)序覆蓋率均在99%以上。

表1 不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)醬油醅料中α多樣性指數(shù)Table 1 α diversity indexes in the soy sauce mash fermented for different time

Shannon-Wiener曲線見圖3，在本次傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油的所有樣本中，曲線逐漸穩(wěn)定。

圖3 Shannon-Wiener曲線分析Fig.3 The analysis of Shannon-Wiener curve

2.4 群落多樣性分析

對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油在不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)下不同樣品獲得的OTU屬水平上進(jìn)行物種注釋，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表2，其中屬水平上相對(duì)豐度大于1%的菌群柱狀分布見圖4。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間樣品菌群在屬水平上的分布Table 2 The distribution of bacterial community in samples at the genus level with different fermentation time

圖4 不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)樣品細(xì)菌的分布Fig.4 The distribution of bacteria in samples with different fermentation time

由表2可知，在發(fā)酵6個(gè)月的醬醅中發(fā)現(xiàn)27個(gè)菌屬，其中豐度較大的菌群為芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、魏斯氏菌屬(Weissella)、大腸桿菌志賀氏菌(Escherichia-Shigella)、色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)、片球菌屬(Pediococcus)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)，在發(fā)酵1年的醬醅中發(fā)現(xiàn)22個(gè)菌屬，主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)，在發(fā)酵2年的醬醅中發(fā)現(xiàn)26個(gè)菌屬，主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、魏斯氏菌屬(Weissella)、色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)，在發(fā)酵3年醬醅中發(fā)現(xiàn)8個(gè)菌屬，在發(fā)酵4年的醬醅中發(fā)現(xiàn)3個(gè)菌屬的，其主要菌屬都為芽孢桿菌屬(Bacillus)，這與之前傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆制品的研究結(jié)果相似[9-11]。表明在傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油過程中，醬醅中細(xì)菌菌群處于動(dòng)態(tài)變化中，且早期出現(xiàn)大腸桿菌志賀氏菌(Escherichia-Shigella)表明傳統(tǒng)自然發(fā)酵衛(wèi)生條件不佳[12]，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，醬醅中細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，形成以芽孢桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬并均趨于穩(wěn)定。其中芽孢桿菌屬(Bacillus)在醬油發(fā)酵過程中可以協(xié)助真菌分解原料中蛋白質(zhì)和淀粉，是醬油中醬香風(fēng)味成分形成的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[13]；腸球菌屬(Enterococcus)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)等乳酸菌屬是一類存在于醬油、魚醬、豆制品等多種發(fā)酵食品及糖漿中的耐鹽或耐高滲壓的乳酸菌，它們?cè)谑称钒l(fā)酵過程中可提高食品中有機(jī)酸、醛類和酯類等風(fēng)味物質(zhì)含量，在提升產(chǎn)品風(fēng)味、維持產(chǎn)品色澤、拮抗有害雜菌、促進(jìn)有益酵母生長(zhǎng)和提高產(chǎn)品功能性等方面具有重要作用[14]。

對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)的醬醅中各微生物豐度的相似性進(jìn)行聚類，傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中微生物總豐度熱圖見圖5。

圖5 各樣本細(xì)菌聚類分析熱圖Fig.5 The heat map of the cluster analysis of bacteria in each sample

結(jié)合聚類分析結(jié)果可知，5個(gè)樣本聚成3類，其中Y1和Y2這2個(gè)樣本聚為一簇，Y3和Y4樣本聚為一簇，表明兩兩之間樣本相似，傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油在發(fā)酵過程中細(xì)菌結(jié)構(gòu)可以分為3個(gè)階段，并于第3年傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油進(jìn)入穩(wěn)定期。綜上，發(fā)酵初期醬油細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化都較大，發(fā)酵中期(1～2年)趨于較穩(wěn)定，發(fā)酵后期(3～4年)形成以芽孢桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬并均趨于穩(wěn)定的細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)采用Canoco for Windows 5.0對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油過程中細(xì)菌菌群，傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油在發(fā)酵過程中各優(yōu)勢(shì)菌隨著發(fā)酵時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化與分布見圖6。

圖6 傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群PCA分析Fig.6 PCA analysis of bacterial community during the fermentation process of traditional natural fermented soy sauce

由圖6可知，橫、縱坐標(biāo)的PC1和 PC2的貢獻(xiàn)率分別為76.32%和14.98%，并且在傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中，第1年和第2年結(jié)構(gòu)相似，第3年和第4年菌群結(jié)構(gòu)相似，呈現(xiàn)出分為3個(gè)階段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律。

3 結(jié)論

本研究對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、魏斯氏菌屬(Weissella)、片球菌屬(Pediococcus)等在內(nèi)的41個(gè)屬。聚類分析結(jié)果顯示，在傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油過程中，醬醅中細(xì)菌菌群處于動(dòng)態(tài)變化中，且早期出現(xiàn)大腸桿菌志賀氏菌(Escherichia-Shigella)表明傳統(tǒng)自然發(fā)酵衛(wèi)生條件不佳，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，醬醅中細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，形成以芽孢桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬并趨于穩(wěn)定；傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油發(fā)酵過程中，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化呈現(xiàn)出3個(gè)發(fā)酵階段，并于第3年進(jìn)入以芽孢桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的發(fā)酵后期，同時(shí)形成趨于穩(wěn)定的細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)。本研究對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了高通量測(cè)序分析，后續(xù)將對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油中真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解構(gòu)，進(jìn)一步揭示傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中的微生物菌群隨著發(fā)酵時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為揭示傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬油獨(dú)特的產(chǎn)品品質(zhì)形成、潛力菌株篩選和傳統(tǒng)自然發(fā)酵釀造技藝優(yōu)化提供了理論依據(jù)。