戴天倫,李洪慶，陶文亮，許子競(jìng)，楊玉瓊

(1.貴州民族大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 貴州特色生物資源工程技術(shù)中心，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)，貴陽(yáng) 550025；3.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院 天然產(chǎn)物中心，貴州 畢節(jié) 551700)

麻竹(DendrocalamuslatiflorusMunro)為多年生禾本科牡竹屬木本植物，廣泛分布于我國(guó)貴州、廣西、云南等南方地區(qū)[1]。目前，赤水市對(duì)麻竹資源的開發(fā)體系已初具規(guī)模，一般用作造紙?jiān)?、編織制品等，又因麻竹生長(zhǎng)迅速，其筍亦可作為食品加工原料[2]。然而，隨著麻竹資源的開發(fā)利用，附帶產(chǎn)生大量的竹葉剩余物，其利用率低，經(jīng)常被當(dāng)作廢棄物丟掉，不僅浪費(fèi)資源，而且污染環(huán)境[3]。諸多研究都表明竹葉多糖具有良好的降血脂、抗氧化、抗疲勞、降血糖等生理功效[4-7]，是一種天然的食品添加劑，已有部分學(xué)者將竹葉多糖作為調(diào)味劑制成各種營(yíng)養(yǎng)保健飲品[8-9]。因此，對(duì)麻竹葉多糖提取工藝及體外抗氧化活性的研究具有較高的理論意義和實(shí)際意義。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于麻竹葉多糖的超聲波輔助提取工藝及抗氧化活性研究鮮有報(bào)道。本研究通過超聲波輔助提取麻竹葉多糖，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，并對(duì)粗多糖清除DPPH·、·OH的能力進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步開發(fā)麻竹葉資源提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麻竹葉：購(gòu)于貴州赤天化紙業(yè)股份有限公司，由貴州民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院蘇春花副教授鑒定為麻竹葉；葡萄糖(AR)：購(gòu)于武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；DPPH(2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基)、硫酸亞鐵、水楊酸、Vc(抗壞血酸)、過氧化氫：購(gòu)于上海浩洋生物科技有限公司；苯酚、無(wú)水乙醇、硫酸：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KQ-500DE 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-1900i紫外分光光度計(jì)、ATY224電子天平 日本Shimadzu公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 常州金南儀器制造有限公司；TD5Z臺(tái)式低速離心機(jī) 鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī) 杭州川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 麻竹葉多糖提取及檢測(cè)

1.2.1.1 麻竹葉多糖提取工藝

取一定量粉碎的麻竹葉，經(jīng)95%乙醇脫脂后，烘干備用。準(zhǔn)確稱取25 g脫脂麻竹葉，置于超聲波清洗機(jī)中，加入適量的純水，超聲波輔助提取，提取3次。合并提取液，濃縮至100 mL，加入濃乙醇調(diào)至含醇80%左右，4 ℃醇沉過夜，離心，得粗多糖沉淀物。沉淀用少量純水溶解，離心過濾，上清液濃縮，醇沉，冷凍干燥，得麻竹葉粗多糖(DLP)。

1.2.1.2 麻竹葉多糖含量的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[10]的方法。以葡萄糖濃度(C)為X軸坐標(biāo)，吸光度(A)為Y軸坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=10.167C+0.0012，R2=0.9998，線性范圍：0～0.08 mg/mL。

將1.2.1.1所得各粗多糖配制成濃度為1.0 mg/mL的溶液，按上述方法檢測(cè)。將測(cè)得的吸光度A帶入上述回歸方程可求得多糖含量，計(jì)算提取率。提取率計(jì)算公式如下：

1.2.1.3 單因素試驗(yàn)

按1.2.1的方法，分別考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間和超聲功率各單因素對(duì)麻竹葉多糖提取率的影響。

1.2.1.4 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在1.2.1.3試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化，以麻竹葉多糖提取率為響應(yīng)值Y，以料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、超聲功率(D)為變量因子，因子編碼及水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因子編碼和水平Table 1 The factors and levels of response surface design test

1.2.2 抗氧化活性試驗(yàn)

稱取干燥麻竹葉粗多糖，配制成一系列不同濃度溶液，檢測(cè)抗氧化活性。

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

依照文獻(xiàn)[11]的方法，在7支試管中先加入2.0 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)，再分別加入4.0 mL不同濃度(0.25，0.5，0.75，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL)的麻竹葉多糖溶液，避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)其吸光度；去離子水代替樣品溶液作為空白組；無(wú)水乙醇代替DPPH溶液作為對(duì)照組；陽(yáng)性對(duì)照為VC。重復(fù)測(cè)定3次，按下式計(jì)算清除率：

式中：A0為對(duì)照組；A1為樣品組；A2為空白樣品組。

1.2.2.2 ·OH清除率的測(cè)定

取7支試管，分別加入1.0 mL不同濃度(0.25，0.5，0.75，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL)的麻竹葉多糖溶液，再依次加入1.0 mL FeSO4溶液(9 mmol/L)、1.0 mL水楊酸(9 mmol/L)，最后加入1.0 mL H2O2(8.8 mmol/L)顯色。靜置40 min后，檢測(cè)吸光度A510 nm[12]；去離子水替換樣品溶液作為空白組；去離子水替換 H2O2溶液作為對(duì)照組；對(duì)照組為Vc。重復(fù)測(cè)定3次，按下式計(jì)算清除率：

式中：A0為對(duì)照組；A1為樣品組；A2為空白樣品組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以O(shè)rigin 2018處理，Design-Expert 8.0.6進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)麻竹葉多糖提取率的影響

固定提取條件為超聲功率300 W、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間40 min，由圖1可知，隨著料液比從1∶10 (g/mL)增大至1∶25 (g/mL)，多糖提取率從1.24%上升到最高值2.08%。之后繼續(xù)增大料液比，多糖提取率趨于平衡。料液比過高會(huì)消耗大量溶劑，也會(huì)增加后續(xù)濃縮工作的時(shí)間。綜合考慮，料液比選取1∶25 (g/mL)最為適宜。

圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.1.2 提取溫度對(duì)麻竹葉多糖提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)固定超聲功率300 W、提取時(shí)間40 min和料液比1∶25 (g/mL)時(shí)，隨著提取溫度的不斷增加，提取率也呈上升趨勢(shì)，在70 ℃時(shí)達(dá)到最大值2.12%。當(dāng)溫度繼續(xù)升至80 ℃時(shí)，提取率下降，可能是過高的溫度對(duì)多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，從而降低提取率。因此，提取溫度選擇70 ℃為宜。

圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)麻竹葉多糖提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)固定超聲功率300 W、提取溫度70 ℃和料液比1∶25 (g/mL)時(shí)，麻竹葉多糖提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值1.2%。隨著提取時(shí)間的延續(xù)，提取率趨于平緩。因此，提取時(shí)間選擇40 min為宜。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extration rate of polysaccharides

2.1.4 超聲功率對(duì)麻竹葉多糖提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)固定料液比1∶25 (g/mL)、提取時(shí)間40 min和提取溫度70 ℃時(shí)，麻竹葉多糖提取率隨著超聲功率的增加而增大，在300 W時(shí)達(dá)到最大值1.45%。而后繼續(xù)增加超聲功率，多糖提取率略有下降。因此，選取300 W為最佳超聲功率。

圖4 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 Box-Benhnken試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The design and results of Box-Benhnken test

續(xù) 表

通過響應(yīng)面軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸系數(shù)的顯著性分析Table 3 The significance analysis of regression coefficients

回歸方程：Y=2.32+0.063A-5.000E-003B+0.034C+8.333E-004D+0.092AB-0.043AC+0.035AD-0.013BC+0.02BD+0.063CD-0.16A2-0.25B2-0.086C2-3.083E-003D2。

該回歸模型F=10.63，方程極顯著(P<0.01)，失擬項(xiàng)F=0.4992>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明該回歸方程可信，能預(yù)測(cè)試驗(yàn)的真實(shí)性。此模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.9140，表明該模型的可信度為90%以上，因此，可以利用此模型來預(yù)測(cè)麻竹葉的多糖含量。單因素A極顯著(P<0.01)；依據(jù)F值大小(FA=10.93>FC=3.18>FB=0.068>FD=1.89E-03)，因此影響因素的大小順序?yàn)锳>C>B>D。A、B、C、D因素兩兩交互作用響應(yīng)面見圖5～圖10。

圖5 料液比與提取溫度的交互影響Fig.5 Interaction between solid-liquid ratio and extraction temperature

由圖5可知，粗多糖提取率隨著料液比的提高而增大，在提取時(shí)間40 min、提取溫度70 ℃和料液比1∶25 (g/mL)時(shí)，等高線上出現(xiàn)極值點(diǎn)，即多糖提取率達(dá)到最大值；由圖6可知，在功率300 W和溫度70 ℃恒定時(shí)，多糖提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，等高線上出現(xiàn)極值點(diǎn)；由圖7可知，超聲功率與料液比的交互作用影響較小，在等高線上無(wú)極值點(diǎn)，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致；由圖8可知，提取時(shí)間與提取溫度交互作用時(shí)，響應(yīng)面圖出現(xiàn)一個(gè)最高點(diǎn)，等高線上出現(xiàn)極值，表明在其他條件不變時(shí)，隨著這兩個(gè)因素的變化，多糖提取率可達(dá)到一個(gè)最大值；由圖9可知，當(dāng)保持提取溫度不變時(shí)，隨著超聲功率變大，多糖提取率變化不大，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，表明超聲功率對(duì)多糖提取率結(jié)果的影響最小，這也符合響應(yīng)面方差分析的結(jié)果；由圖10可知，超聲功率與提取時(shí)間的交互作用影響較小；由以上分析可以看出，在其他兩因素不變時(shí)，料液比對(duì)多糖提取率的影響最大，時(shí)間次之，超聲功率對(duì)多糖提取率的影響最小，這與方差分析結(jié)果一致，表明該模型可靠，可用于指導(dǎo)麻竹葉多糖的提取。

圖6 料液比與提取時(shí)間的交互影響Fig.6 Interaction between solid-liquid ratio and extraction time

圖7 料液比與超聲功率的交互影響Fig.7 Interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic power

圖8 提取溫度與提取時(shí)間的交互影響Fig.8 Interaction between extraction temperature and extraction time

圖9 提取溫度與超聲功率的交互影響Fig.9 Interaction between extraction temperature and ultrasonic power

圖10 提取時(shí)間與超聲功率的交互影響Fig.10 Interaction between extraction time and ultrasonic power

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及驗(yàn)證

對(duì)響應(yīng)面回歸方程求一次偏導(dǎo)，聯(lián)立方程解得理論最佳提取參數(shù)為：料液比1∶25.05 (g/mL)、提取溫度69.07 ℃、提取時(shí)間39.2 min、超聲功率289.7 W。根據(jù)試驗(yàn)實(shí)際情況，調(diào)整提取參數(shù)為：料液比1∶25 (g/mL)、提取溫度69 ℃、提取時(shí)間39 min、超聲功率300 W，3次平行試驗(yàn)得出麻竹葉多糖平均提取率為2.26%，將理論參數(shù)帶入響應(yīng)面模型得到預(yù)測(cè)值為2.22%，相對(duì)誤差為1.77%，表明該模型可靠。

2.3 麻竹葉多糖體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 麻竹葉多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖11可知，麻竹葉多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)，多糖濃度從0.25 mg/mL升至3.0 mg/mL時(shí)，其清除率隨著濃度增加而升高，當(dāng)濃度增到3.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到77.8%，當(dāng)多糖濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力可達(dá)Vc的96.8%，表明麻竹葉多糖對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除作用。

圖11 粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.11 The DPPH radical scavenging rate of crude polysaccharides

2.3.2 麻竹葉多糖對(duì)·OH的清除能力

由圖12可知，隨著多糖濃度的升高，其對(duì)·OH的清除率從8.25%提高到47.1%，但當(dāng)麻竹葉多糖濃度達(dá)到2.0 mg/mL后，繼續(xù)升高多糖濃度，對(duì)·OH的清除率增加緩慢；多糖濃度為4.0 mg/mL時(shí)，麻竹葉多糖對(duì)·OH的清除率最高，可達(dá)Vc的58.2%，由此表明麻竹葉多糖對(duì)·OH有一定清除能力。

圖12 粗多糖對(duì)羥自由基的清除率Fig.12 The hydroxyl radical scavenging rate of crude polysaccharides

3 結(jié)論

在考察不同料液比、提取溫度、提取時(shí)間和超聲功率單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面軟件的設(shè)計(jì)來優(yōu)化超聲輔助提取麻竹葉多糖的工藝，得到最佳實(shí)際工藝參數(shù)為：料液比為1∶25 (g/mL)、提取溫度69 ℃、提取時(shí)間39 min、超聲功率300 W，經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖平均實(shí)際提取率為2.26%，其響應(yīng)面模型得到理論值為2.22%，相對(duì)誤差為1.77%，表明該模型真實(shí)性高，可用于麻竹葉多糖的提取。體外抗氧化活性試驗(yàn)表明，麻竹葉多糖具有良好的抗氧化活性。其中，多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于玉竹多糖[13]；在濃度為4.0 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除能力可達(dá)到同等濃度下Vc的58.2%。說明麻竹葉多糖在食品工業(yè)中具有很大的潛力，不僅能使食品具有竹葉清香，更能增強(qiáng)食品的抗氧化能力。