陳柏錫，孫嘉昊，劉 威，張文琪，吳曉輝

青島新希望琴牌乳業(yè)有限公司，山東青島 266000

0 引言

隨著我國經(jīng)濟(jì)水平的快速增長和國民購買力的普遍提高，以乳制品為首的健康食品產(chǎn)業(yè)正在蓬勃發(fā)展，乳制品的產(chǎn)量、銷量、市場需求量和進(jìn)口量均大幅上漲，與乳制品市場規(guī)模發(fā)展相伴而來的是對乳制品檢驗(yàn)工作更加嚴(yán)格的要求，尤其是對乳制品中農(nóng)藥、獸藥殘留；食品添加劑以及違禁品的檢測更為嚴(yán)格。高效液相色譜法具有檢出限低，精度高，重復(fù)性好的特點(diǎn)，而且可實(shí)現(xiàn)操作的自動化，能夠在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行數(shù)量眾多樣品的日常分析，所以在檢驗(yàn)領(lǐng)域占有十分重要的地位[1]。而在液相色譜法中，反相色譜因其可調(diào)節(jié)參數(shù)多，試劑成本較低，污染較小，普適性較強(qiáng)等特性，被廣泛應(yīng)用于食品檢測中。本文以反相色譜法為研究對象，詳細(xì)介紹了反相色譜方法的開發(fā)與優(yōu)化步驟，對可優(yōu)化的參數(shù)逐一列舉，對于食品檢測方法的開發(fā)具有一定的參考價(jià)值。

1 反相色譜方法的建立

要對某種或多種目標(biāo)物質(zhì)建立合適的分析方法，首先要收集目標(biāo)物質(zhì)的相關(guān)信息以及確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室的儀器條件，從而篩選可行的分析方法。選取合適的色譜條件是必不可少的，如：流動相的種類、色譜柱型號、進(jìn)樣量、柱溫、檢測器種類等，通過連續(xù)的實(shí)驗(yàn)確定色譜條件后，還要根據(jù)具體的出峰情況對方法進(jìn)行優(yōu)化以得到更好的檢測效果。根據(jù)流動相和固定相極性的不同，液相色譜可分為正相色譜和反相色譜，反相色譜用超純水做基礎(chǔ)溶劑，用極性弱于水的有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈等做有機(jī)相[2]，由于反相色譜可以調(diào)節(jié)的參數(shù)更多，普適性也更強(qiáng)，所以本文以反相色譜法的建立與優(yōu)化為例，以供參考。

1.1 收集目標(biāo)物信息

首先要確定待測目標(biāo)的個(gè)數(shù)、種類、相對分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)種類、溶解度以及酸度系數(shù)（pKa）和濃度范圍。上述信息的收集對于方法選擇和建立是至關(guān)重要的。如果目標(biāo)物數(shù)量過多則需要在方法建立之初考慮目標(biāo)峰分離的問題，而待測物質(zhì)的相對分子質(zhì)量通常會影響色譜條件的選擇，一般分子量較大的目標(biāo)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)分子、核酸或一些聚合物通常需要使用大孔徑的色譜柱，分子量較小的化合物可以使用后文介紹的通用初始色譜條件。分子結(jié)構(gòu)及官能團(tuán)決定了檢測器的種類和波長的選擇，比如亞砜（S=O鍵）在210 nm具有較好的吸光度，而碘化物在280 nm處吸光度最大，如果能得到目標(biāo)樣品的光譜圖，則能夠快速的得知檢測器的最佳波長。對于目標(biāo)物質(zhì)的溶解度需要進(jìn)行簡單的分類，一般能溶于水相或甲醇、乙腈類有機(jī)溶劑的樣品，通常使用反相色譜法進(jìn)行檢測，若樣品只能溶于正己烷等低極性的有機(jī)溶劑，則要考慮正相色譜或其他的分析方法。若目標(biāo)樣品是弱酸、弱堿類的非中性化合物，需考慮在流動相中添加相應(yīng)的緩沖鹽溶液調(diào)整其pH值。綜上所述，對于目標(biāo)物質(zhì)的研究越充分，信息收集的越完善，越利于后期方法的建立和優(yōu)化。

1.2 初始方法的建立

當(dāng)確定該目標(biāo)物質(zhì)能夠使用反相色譜的方法進(jìn)行分離時(shí)，需要一個(gè)初始色譜條件作為摸索和優(yōu)化檢測方法的開端。初始條件中流動相一般使用較高的有機(jī)溶劑比例，對樣品出峰的先后順序以及特點(diǎn)進(jìn)行分析，再進(jìn)行具體的色譜條件調(diào)節(jié)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，以下色譜條件作為初始色譜條件，普適性較好：選擇C18色譜柱（ODS柱），進(jìn)樣體積20 μL，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測器波長根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)官能團(tuán)的不同進(jìn)行具體的選擇，流動相選擇80%的甲醇或乙腈，運(yùn)行時(shí)間調(diào)整為40～60 min，在初始條件下觀察出峰結(jié)果。由于初始色譜條件的流動相有機(jī)溶劑比例較高，所以出峰時(shí)間相對較快，多個(gè)目標(biāo)峰聚集較為密集，若在初始條件下仍有目標(biāo)物質(zhì)未出峰，則要考慮溶劑強(qiáng)度更高的有機(jī)溶劑，如四氫呋喃、乙腈等。

1.3 流動相的選擇和調(diào)整

反相色譜的流動相通常由有機(jī)相與水溶液（緩沖液）組成，可以通過調(diào)節(jié)有機(jī)相的種類、比例以及調(diào)節(jié)流動相的pH值達(dá)到提高分離度、改善峰型、改善目標(biāo)物保留值等目的，這是其他色譜方法所不具備的優(yōu)勢。當(dāng)用初始色譜條件能夠檢測到目標(biāo)物質(zhì)出峰后，根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)的出峰時(shí)間降低有機(jī)相的比例，直到目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間在一個(gè)合適的區(qū)間。改變有機(jī)溶劑的種類同樣可以改變目標(biāo)物質(zhì)的出峰時(shí)間，通常情況下有機(jī)溶劑的溶劑強(qiáng)度越大，洗脫能力越強(qiáng)，目標(biāo)物質(zhì)出峰速度越快。相同比例的有機(jī)相-水溶液的洗脫能力：四氫呋喃＞乙腈＞甲醇。某些弱酸或弱堿性物質(zhì)在水溶液中會發(fā)生電離，導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)在色譜柱上保留值很低甚至完全不保留，此時(shí)可以使用不同種類的緩沖鹽溶液來調(diào)節(jié)流動相的pH值，減少目標(biāo)物質(zhì)的電離。

通常在對上文給出的初始條件下分離得到的結(jié)果進(jìn)行流動相參數(shù)調(diào)整時(shí)，宜按照以下步驟操作：先改變有機(jī)相的比例，如：將80%的甲醇水調(diào)整為65%甲醇水，當(dāng)只改變有機(jī)相比例不足以滿足實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，應(yīng)改變有機(jī)相的種類，如將甲醇替換成乙腈或四氫呋喃，或者將幾種有機(jī)溶劑按照一定比例進(jìn)行混合。當(dāng)調(diào)整了有機(jī)溶劑比例和種類后，目標(biāo)物質(zhì)仍然出現(xiàn)較低的保留值，則應(yīng)考慮使用不同pH值的緩沖溶液，提高目標(biāo)物質(zhì)的保留值。磷酸緩沖液最常用的緩沖溶液，通過配制0.2 M磷酸二氫鈉溶液和0.2 M磷酸氫二鈉溶液，按照一定比例進(jìn)行混合，可以配制出不同pH值的磷酸緩沖液。

2 反相色譜方法的優(yōu)化

在建立一個(gè)檢測方法之初，新的方法不可能是完善的，通常會出現(xiàn)如：分離度不滿足要求，回收率較低，出峰時(shí)間過早或過晚，噪聲信號過高影響方法檢出限等問題，所以對新建立的方法進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整是必要的。

2.1 改善分離度

分離度是評價(jià)多個(gè)組分之間分離效果的重要指標(biāo)，其數(shù)值等于兩峰頂點(diǎn)的間距與兩峰峰底寬之和比值的兩倍，即：兩峰的頂點(diǎn)間隔越遠(yuǎn)，兩個(gè)峰寬度越窄、越尖銳，分離度越好。一般在優(yōu)化分離度時(shí)通常使用如下公式：

其中Rs為兩目標(biāo)物之間的分離度，N為理論塔板數(shù)，α為兩峰保留值的比值，k為兩峰保留值之和的平均值。根據(jù)上述公式，要提高兩種目標(biāo)物的分離度可以通過提高理論塔板數(shù)N來實(shí)現(xiàn)，比如使用更長的色譜柱通常會改善分離效果。通過調(diào)整流速也可以提高柱效，一般情況下低流速擁有更高的柱效，但流速不宜過低，一般在0.8～1.5 mL/min為佳。通過提高目標(biāo)峰的保留值，也可以提高目標(biāo)物之間的分離度，比如降低流動相中有機(jī)溶劑的比例、將有機(jī)溶劑更換為溶劑強(qiáng)度較弱的，如把乙腈換為甲醇等，但提高保留值或者使用較長色譜柱的同時(shí)，通常會使得出峰時(shí)間后延，所以要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體需要加以權(quán)衡。

2.2 優(yōu)化出峰時(shí)間

經(jīng)過前處理后的樣品中會含有少量的保留值較低的雜質(zhì)，當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)的出峰時(shí)間過早時(shí)，有可能與雜質(zhì)峰相互重疊，為了權(quán)衡出峰效果和工作效率，一般將出峰時(shí)間調(diào)整在10～30 min[3]。通過調(diào)整流速、有機(jī)相的比例等可以達(dá)到調(diào)整出峰時(shí)間的效果，通常有機(jī)溶劑的比例越高，出峰速度越快。在方法建立之初，可以根據(jù)實(shí)際的出峰效果，選擇更長或更短的色譜柱達(dá)到增加和縮短出峰時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中偶爾會發(fā)生出峰時(shí)間波動的現(xiàn)象，其原因有可能是色譜柱溫度范圍控制不當(dāng)導(dǎo)致溫度波動太大所導(dǎo)致的，也可能是由于流動相未充分混勻?qū)е陆M分發(fā)生變化產(chǎn)生的[4]，尤其是流動相添加了多種組分，如：離子對試劑、峰拖尾改善劑等，應(yīng)注意搖勻后抽濾使用。

2.3 提高信噪比

信噪比（S/N）是目標(biāo)物質(zhì)信號與噪聲信號的比值，在液相色譜的圖譜中通常使用目標(biāo)峰扣基線后的高度與基線寬度做比值。提高信噪比對于提高檢測精度和確定檢出限、定量限均具有重要意義[5]。提高信噪比要從提高目標(biāo)信號或降低噪聲信號入手。提高目標(biāo)信號可以通過：增加樣品濃度、增加進(jìn)樣體積、選擇合適的檢測器波長等方法實(shí)現(xiàn)，但樣品濃度或進(jìn)樣體積過大也會造成峰展寬、拖尾等現(xiàn)象，需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)節(jié)。噪聲信號主要是基線不平穩(wěn)抖動產(chǎn)生的，通常流動相或其他溶劑中的氣泡會導(dǎo)致基線的抖動，增加噪聲信號，流動相配制后經(jīng)過0.22 μm濾膜進(jìn)行抽濾，配制流動相的試劑選擇色譜純或優(yōu)級純，配制完成后進(jìn)行超聲排氣，在檢測時(shí)將沖洗閥擰松，用大流量進(jìn)行排氣5～10 min，并使用儀器自帶的在線脫氣系統(tǒng)進(jìn)一步將溶劑中的氣泡排出，可以保證基線平穩(wěn)[6]。當(dāng)色譜柱被污染時(shí)，也會造成噪聲信號的提高，所以在檢測時(shí)安裝保護(hù)柱是必要的，當(dāng)色譜柱被樣品污染時(shí)，可以使用高溶劑強(qiáng)度的試劑，如純甲醇或乙腈對色譜柱進(jìn)行沖洗，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對色譜柱進(jìn)行沖洗和純甲醇充滿色譜柱的操作也能夠避免樣品的污染。另外，柱溫箱溫度的波動和系統(tǒng)壓力的波動也會增加噪聲信號。

2.4 優(yōu)化系統(tǒng)壓力

當(dāng)液相色譜系統(tǒng)中的流速固定時(shí)，理論上系統(tǒng)的壓力也是一定的，當(dāng)系統(tǒng)的壓力不穩(wěn)定或出現(xiàn)壓力偏高或偏低時(shí)應(yīng)考慮系統(tǒng)內(nèi)部的異常[7]。正常液相色譜系統(tǒng)的壓力應(yīng)在150 bar以下。流速過快會導(dǎo)致系統(tǒng)壓力的上升，通常流速在1.0～1.5 mL/min為最佳，不宜超過2.0 mL/min[8]。流動相的黏度也會影響系統(tǒng)的壓力，當(dāng)系統(tǒng)壓力偏高時(shí)應(yīng)考慮更換黏度更低的流動相，如將甲醇替換為乙腈等。當(dāng)同一個(gè)檢測方法在參數(shù)未發(fā)生改變，但兩次檢測壓力差距過大時(shí)應(yīng)考慮儀器內(nèi)部設(shè)備是否出現(xiàn)堵塞的現(xiàn)象，如色譜柱堵塞、過濾白頭堵塞等。色譜柱所處的溫度對系統(tǒng)壓力也有一定的影響，通常柱溫越高，壓力越低[9]。

2.5 改善峰拖尾

峰拖尾是最常見的峰型異常情況，一般的峰拖尾會影響檢測結(jié)果的精度、柱間重復(fù)性等，而嚴(yán)重的峰拖尾會拖延至下一目標(biāo)峰中，影響二者的分離度[10]。峰拖尾常出現(xiàn)在使用過度的色譜柱中，當(dāng)色譜柱被強(qiáng)保留樣品污染時(shí)造成的峰拖尾可以使用強(qiáng)溶劑進(jìn)行沖洗，沖洗順序?yàn)椋杭兗状肌惐肌燃淄椤惐肌兗状?。必要時(shí)也可以用強(qiáng)溶劑低流速對色譜柱進(jìn)行反沖。

峰拖尾也有可能是柱外效應(yīng)導(dǎo)致的，尤其是當(dāng)色譜系統(tǒng)的死體積較大時(shí)易出現(xiàn)拖尾。柱外效應(yīng)導(dǎo)致的拖尾現(xiàn)象通常是先出的峰拖尾嚴(yán)重，越靠后的峰拖尾越輕的規(guī)律，可以采取減少儀器組件之間管路連接長度，使用體積較少的流通池以降低死體積，并注意樣品濃度和進(jìn)樣體積，避免過載。目前越來越多的研究者用減小流動相 pH 值或者添加三乙胺等物質(zhì)抑制硅羥基的解離，從而降低峰拖尾的現(xiàn)象[11]。

3 總結(jié)

無論是根據(jù)已有的液相色譜分析方法進(jìn)行優(yōu)化，還是重新建立一個(gè)分析方法，都應(yīng)該以最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為導(dǎo)向，并從前處理、色譜條件、分析過程與最終結(jié)果等多個(gè)方面綜合考量，在具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖譜當(dāng)中找到可以優(yōu)化的點(diǎn)，并將其與具體的色譜條件結(jié)合起來，修正條件后重復(fù)實(shí)驗(yàn)直到過程和結(jié)果均趨于穩(wěn)定。當(dāng)改變某個(gè)色譜條件時(shí)通常會引起多個(gè)參數(shù)的改變，應(yīng)在設(shè)計(jì)方法時(shí)加以權(quán)衡，找到最適合當(dāng)前色譜條件的分析方法。C