馮暄，郝勝菊，張慶華，何靜，張釧，藺鵬武，郭媛媛，周秉博

(甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，蘭州 730050)

近年來，隨著國家“二胎政策”的開放，高齡孕婦的生育需求增加。孕婦高齡(advanced maternal age, AMA)是導(dǎo)致胎兒染色體異常的重要因素[1]。高齡可造成卵巢功能衰退，卵子逐漸老化以及環(huán)境因素的累積，使生殖細胞或受精卵在減數(shù)分裂時期發(fā)生染色體不分離的風(fēng)險增加[2]。經(jīng)典的染色體核型分析技術(shù)作為產(chǎn)前診斷的金標準，其分辨率約為10 Mb[3]。近年來，作為高分辨率基因組的染色體微陣列(CMA)技術(shù)也逐漸被用于遺傳疾病的產(chǎn)前診斷，但其成本較高、通量較低，因此，該技術(shù)多用于檢測產(chǎn)前診斷中超聲結(jié)構(gòu)異常的胎兒[4]。隨著二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，低深度全基因組測序技術(shù)(CNV-seq)憑借檢測范圍廣、精準、通量高、成本低、操作簡便等諸多優(yōu)勢被迅速應(yīng)用于產(chǎn)前診斷領(lǐng)域。本研究擬將CNV-seq聯(lián)合染色體核型分析技術(shù)應(yīng)用于高齡孕婦的產(chǎn)前診斷，以期進一步探討CNV-seq技術(shù)在高齡孕婦產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年1月至2019年12月于甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心單純因高齡行羊水穿刺的羊水樣本1 395份。納入標準：(1)孕婦年齡≥35歲；(2)胎兒超聲檢查結(jié)果顯示為正常；(3)無臨床病歷資料缺失；(4)均為單胎妊娠。排除標準：(1)既往有不良孕產(chǎn)史者；(2)產(chǎn)前篩查結(jié)果顯示為高風(fēng)險病例；(3)孕期接觸過有害因素者；(4)交流溝通能力障礙或伴有精神疾病者。孕婦年齡35～54歲，孕周18+4～28周。樣本均進行CNV-seq和染色體G顯帶核型分析技術(shù)檢測。本研究通過甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(2018院倫審研第30號)，各研究對象及家屬均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 T100 PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)，StepOne plus熒光定量PCR儀(美國Life Technologies公司)，NextSeqCN500高通量測序儀(美國Illumina公司)，5810R低速低溫離心機、5424小型高速離心機(德國Eppendorf公司)，J2A900超凈工作臺(蘇州凈化工程公司)，CKX-41倒置顯微鏡、CX31-12CO生物顯微鏡(日本Olympus公司)，DM6000熒光顯微鏡(德國Leica公司)，QubitFluorometer 核酸定量儀、Forma i160 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)。核酸提取試劑盒(德國Qiagen公司)，核酸純化試劑盒(美國Zymo Research公司)，染色體拷貝數(shù)變異檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)、文庫構(gòu)建純化試劑、NextSeqCN500高通量測序試劑盒(北京貝瑞和康公司)，熒光定量檢測試劑盒(美國Kapa公司)，Gibico羊水培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher公司)，秋水仙素、EDTA(美國Life Technologies公司)，胰蛋白酶(德國Sigma公司)，Gimsa染液(美國Promega公司)。

1.3方法

1.3.1羊膜腔穿刺及羊水染色體G顯帶核型分析 羊膜腔穿刺術(shù)由甘肅省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心醫(yī)師經(jīng)B超引導(dǎo)下進行。每例孕婦抽取3管羊水，每管10 mL，其中2管羊水進行細胞培養(yǎng)，供染色體核型分析，剩余1管進行CNV-Seq檢測。羊水樣本送至醫(yī)學(xué)遺傳中心細胞遺傳實驗室，按照標準的操作方法進行細胞培養(yǎng)，經(jīng)2 000 r/min離心10 min，棄上清液，取1.5～2.0 mL羊水及沉淀細胞，吸吹打勻后接種于含羊水培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6～7 d后換液1次，觀察細胞生長情況。8～12 d收獲，當(dāng)細胞貼壁生長旺盛，鏡下見大片克隆且有較多圓型及雙核細胞時即可收獲。收獲前加入濃度為100 μg/mL的秋水仙素100 μL，采用2.5 g/L胰蛋白酶和20 g/L EDTA 1∶1混合消化。再經(jīng)過低滲、預(yù)固定、固定、制片等步驟，制得的標本按照人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(2013)標準，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)20個中期分裂相，分析5個核型。

1.3.2羊水細胞CNV-seq檢測 取10 mL羊水，按照染色體拷貝數(shù)變異檢測試劑盒說明書進行樣本基因組DNA提取，對獲得的DNA用核酸純化試劑盒進行純化。按照染色體拷貝數(shù)變異檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)說明書構(gòu)建 DNA 文庫。采用NextSeq CN500 高通量測序試劑盒及NextSeqCN500高通量測序儀對純化、定量后的 DNA 文庫進行測序。比對分析：將獲取的讀長和已知的人類參考基因組進行完全匹配比對。在此過程中需將人類基因組分成若干個連續(xù)區(qū)域，統(tǒng)計不同區(qū)域內(nèi)的樣本完全匹配讀長數(shù)，按照統(tǒng)計結(jié)果完成樣本間的Log2比值計算，并通過特定算法判定待測樣本的染色體情況。

1.3.3生物信息學(xué)分析 測序所得的讀長與人類參考基因組(NCBI GRCh37，UCSC release hgl9)進行比對，分析得到生物信息學(xué)結(jié)果，通過檢索Decipher數(shù)據(jù)庫(Database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resource)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、PubMed數(shù)據(jù)庫和UCSC Genome Browser(University of California Santa Cruz)、Clinvar等數(shù)據(jù)庫查詢，對檢測到的CNV的致病性進行評估。最終參照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)遺傳變異分類標準與指南[5]，將檢測樣本中發(fā)現(xiàn)的CNVs 分為以下 5個級別：明確致病性CNVs(pCNVs)，可能致病CNVs(LP CNVs)，臨床意義未明CNVs(VUS CNVs),良性 CNVs(B CNVs),可能良性 CNVs(LB CNVs)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。應(yīng)用相關(guān)性分析評估pCNVs發(fā)生的片段大小、疾病種類與孕婦年齡的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5隨訪 對檢測出的19例pCNVs樣本進行隨訪，12例選擇了終止妊娠，7例選擇繼續(xù)妊娠，目前均尚未見異常表型，但年齡最大的嬰兒目前尚出生后不滿1年，是否有發(fā)育遲緩及智力低下等其他表型目前尚不能充分判斷，需繼續(xù)追蹤隨訪才能明確預(yù)后。

2 結(jié)果

2.1染色體G顯帶核型分析結(jié)果 1 395例樣本中檢出染色體異常49例，陽性檢出率為3.51%(49/1 395)。檢出染色體非整倍體異常28例(嵌合體2例)，檢出率為2.00%(28/1 395)；染色體平衡易位3例；染色體多態(tài)18例，檢出率為1.29%(18/1 395)。

2.21 395例羊水樣本CNV-seq檢測結(jié)果 檢出染色體非整倍體及100 Kb以上的拷貝數(shù)變異134例，陽性檢出率為9.61%(134/1 395)。檢出染色體非整倍體異常30例(其中嵌合體5例)，檢出率為2.15%(30/1 395)；pCNVs 19例，檢出率為1.36%(19/1 395)，VUS CNVs 37例，B CNVs/LB CNVs 48例。見表1。

表1 1 395例孕婦CNV-seq檢測結(jié)果[n(%)]

2.3CNV-seq與染色體核型結(jié)果分析 在嵌合體檢測中，兩種方法共檢出嵌合體5例，有3例嵌合體用核型分析和CNV-seq均檢出，有2例用CNV-seq檢出而核型分析未檢出。另外，CNV-seq檢測出的19例pCNVs用染色體核型分析均未檢出。CNV-seq未能檢出核型分析檢出的4例結(jié)構(gòu)平衡易位。

2.4CNV-seq檢出樣本的pCNVs結(jié)果分析 在檢出的19例pCNVs樣本中，檢出微缺失綜合征(microdeletion syndrome)7例，分別為16p11.2 微缺失綜合征、2p16.3微缺失綜合征、1p36 微缺失綜合征、6q11-q14微缺失綜合征、1q21.1復(fù)發(fā)性微缺失綜合征(神經(jīng)發(fā)育障礙的易感位點，2例)、22q13微缺失綜合征。檢出微重復(fù)綜合征(microduplication syndrome)4例，分別為18p四體綜合征、16p11.2微重復(fù)綜合征(2例)、1q21.1復(fù)發(fā)性微重復(fù)綜合征。另外,在檢出8例其他致病性結(jié)果的樣本中，檢出單基因病2例(病例1、24)，均為進行性肌營養(yǎng)不良(DMD)。病例1為男胎DMD患兒，引產(chǎn)；病例24為女胎DMD攜帶者，正常分娩，隨訪。2例樣本及其母親均經(jīng)MLPA技術(shù)驗證，結(jié)果一致；另有5例為致病性綜合征，分別為遺傳性壓力易感性周圍神經(jīng)病(2例)、先天性橈骨發(fā)育不全綜合征、9q亞端粒缺失綜合征、腎囊腫-糖尿病綜合征；另外1例檢測結(jié)果為XXY綜合征。

2.519例pCNVs發(fā)生的片段大小、疾病類型與孕婦年齡的關(guān)系 19例pCNVs發(fā)生的片段大小、疾病種類與孕婦年齡的分布情況見表2。對pCNVs發(fā)生的片段大小與年齡進行相關(guān)性分析結(jié)果顯示， pCNVs發(fā)生的片段大小與孕婦年齡呈顯著負相關(guān)性(r=-0.636,P<0.01)。對pCNVs發(fā)生的疾病類型與年齡進行相關(guān)性分析結(jié)果顯示， pCNVs發(fā)生的疾病種類與孕婦年齡不存在顯著相關(guān)性(r=0.324，P=0.176)。

表2 19例pCNVs發(fā)生的片段大小、疾病類型與孕婦年齡的分布情況

3 討論

隨著高齡孕婦增多，其發(fā)生染色體異常的風(fēng)險也增大。因此，對高齡孕婦的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢非常關(guān)鍵。本研究通過回顧性分析1 395例高齡孕婦的產(chǎn)前診斷結(jié)果，探討高齡孕婦胎兒染色體核型異常及拷貝數(shù)變異檢出情況，為臨床咨詢提供參考依據(jù)。

近年來，CNV-seq技術(shù)在遺傳學(xué)診斷和產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用不斷深入。《低深度全基因組測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識》[6]為CNV-seq技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的規(guī)范應(yīng)用提供了指導(dǎo)建議。有研究報道，孕婦的年齡增長會導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生率的上升[7]。在本研究中，高齡孕婦胎兒染色體異常檢出率為9.61%，較文獻[8]報道羊水穿刺指征的檢出率(3.96%)明顯升高，亦高于新生兒自然發(fā)生率(0.67%～0.83%)。Wang等[9]報道CNV-seq技術(shù)相較于核型分析對致病性或可能致病性CNVs的檢出率由1.8%提高至2.8%。Zhu等[10]對全國各地46 258例高齡孕婦的羊水核型分析結(jié)果表明，致病性染色體異常的檢出率為1.53%。Wang等[11]對CNV-seq技術(shù)與芯片的臨床應(yīng)用進行比較分析，結(jié)果證實與芯片相比，CNV-seq技術(shù)不僅對DNA起始量要求更低，擁有更高的檢測分辨率，并且對致病、可疑致病性CNVs檢出率提高了1.7%，技術(shù)重復(fù)率從4.6%降低至0.5%。在本研究中，染色體異常檢出率由3.51%上升至9.61%，pCNVs樣本檢出率由2.00%提高至3.51%。本研究的結(jié)果與Wang等[11]的研究基本一致，但高于Zhu等[10]的研究結(jié)果，表明CNV-seq技術(shù)有較高的可靠性和準確性，特別是在高齡孕婦的產(chǎn)前診斷中可以顯著提高染色體異常的檢出率，特別是對pCNVs的檢出有著明顯優(yōu)勢。CNV-seq依然具有局限性，例如該技術(shù)為單端測序，無法檢測出不涉及基因劑量改變的染色體異常[12]。本研究采用CNV-seq技術(shù)檢測漏診了3例平衡易位。在既往產(chǎn)前診斷中出現(xiàn)胎兒染色體易位時，通過父母核型分析胎兒染色體來源，如果胎兒染色體結(jié)果與雙親之一相同，無重復(fù)或缺失，則不影響表型和智力發(fā)育[13]。

本研究中發(fā)現(xiàn)3例核型與CNV-seq結(jié)果不一致的樣本，其中2例是由于低比例嵌合體導(dǎo)致核型無法被檢出。有研究報道，CNV-seq聯(lián)合染色體核型分析可彌補單一檢測方法診斷嵌合體出現(xiàn)誤診的不足[14]。另有研究報道證實CNV-seq技術(shù)可檢測低至5%的嵌合體[15]。本研究共檢出5例嵌合體，其中2例為低比例的染色體非整倍體異常的嵌合體(嵌合比例為15%和12%)，核型均未見異常。染色體核型方法嵌合體檢出率為0.22%(3/1 395)，CNV-seq技術(shù)的嵌合體檢出率為0.39%(5/1 395)。2例結(jié)果不一致的樣本最終通過熒光原位雜交(FISH)檢測，確定結(jié)果與CNV-seq結(jié)果一致，這也說明了CNV-seq技術(shù)在染色體低比例嵌合的檢測中具有更高的靈敏度，且能評估整條染色體的拷貝數(shù)情況。另1例不一致的樣本用CNV-seq檢測結(jié)果為X染色體p22.33-q28處重復(fù)151.38 Mb區(qū)域，推測核型為47,XXY；Y染色體q11.1-q12處缺失15.70 Mb區(qū)域，包含全部無精子因子(AZF)區(qū)，該區(qū)域缺失與嚴重的生精障礙密切相關(guān)，會導(dǎo)致嚴重的少弱精癥和無精子癥。該樣本核型結(jié)果：46，XX。排除標本誤差后，采用多重連接依賴式探針擴增技術(shù)(MLPA)方法將剩余羊水樣本對P095探針和P360探針進行檢測，P095結(jié)果顯示，該樣本為47，XXY，UTY-1位點缺失(AZF基因位于該區(qū)域)SRY基因存在；P360結(jié)果顯示，該樣本AZF基因A、B、C 3個區(qū)域均缺失。根據(jù)3種方法的結(jié)果綜合推測，Y染色體上檢測出的缺失片段可能插入到X染色體，導(dǎo)致核型結(jié)果為46，XX。經(jīng)查詢，該患者為高齡孕婦，如果不進行CNV-seq，其染色體異常有可能無法被檢測出。此外，當(dāng)核型與CNV-seq結(jié)果不一致時，須用第3種方法進行驗證，為臨床提供最準確的依據(jù)。

研究證實，CNVs在臨床的發(fā)生率為1%～1.7%，其發(fā)生與孕婦年齡無關(guān)，發(fā)生率高于唐氏綜合征[16]。本研究結(jié)果提示在國內(nèi)高齡孕婦人群中，pCNVs發(fā)生與疾病類型并不相關(guān)，但孕婦年齡卻與pCNVs的片段大小具有顯著相關(guān)性。尤其發(fā)現(xiàn)對于>40歲的高齡孕婦，隨著年齡的增大，其發(fā)生小片段(<1 Mb)pCNVs的風(fēng)險越高。這進一步說明了對高齡孕婦使用CNV-seq技術(shù)聯(lián)合染色體核型分析，在產(chǎn)前診斷中具有重要的臨床意義。

綜上所述，CNV-seq技術(shù)不僅能檢測出染色體非整倍體異常，還可以發(fā)現(xiàn)染色體的微缺失和微重復(fù)。因此，在對高齡孕婦實施產(chǎn)前診斷時，將CNV-seq與染色體核型分析技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，可以為醫(yī)生提供更詳細、全面的胎兒染色體信息，減少誤診、漏診。該技術(shù)將有效提高致病性檢出率，降低出生缺陷，為臨床的產(chǎn)前咨詢提供有效可靠的依據(jù)。