馬宇軒 謝立娜 譚麗芹 梁克紅 趙姍姍 郄夢潔 胡翔宇 趙 燕,*

(1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3遼寧省北票市長皋農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，遼寧 北票 122000；4 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所，北京 100081)

牛奶作為高營養(yǎng)價(jià)值食品，富含礦物元素，對人體健康有積極作用。導(dǎo)致牛奶中營養(yǎng)元素含量出現(xiàn)差異的因素有物種[1-3]、地區(qū)來源[4-5]及泌乳期[6-7]等。隨著中國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，乳制品行業(yè)取得了巨大進(jìn)步，市場需求量也不斷增加。然而，三鹿奶粉事件和特侖蘇牛奶“OMP”事件的爆發(fā)不僅嚴(yán)重影響了中國的乳制品行業(yè)發(fā)展，而且嚴(yán)重?fù)p害了人民的利益。當(dāng)乳制品出現(xiàn)問題時(shí)，可通過產(chǎn)地溯源技術(shù)跟蹤乳制品生產(chǎn)，追蹤其來源，確定其真實(shí)性，進(jìn)而確保人民的利益。因此，建立乳制品產(chǎn)地溯源模型可以有效保障乳制品的安全及真實(shí)性，保護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益。

礦物元素分析是確定農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地的一種有效方法。近年來，礦物元素技術(shù)在橄欖油[8]、梨[9]、牦牛肉[10]等多種農(nóng)產(chǎn)品中用于追溯產(chǎn)地來源。國內(nèi)外已開展了大量針對乳制品產(chǎn)地溯源的研究[11-14]。Vatavali等[15]、譚凱燕等[16]及Necemer等[17]通過測定乳及乳制品中礦物元素含量，對不同來源的乳及乳制品進(jìn)行了有效判別。由此說明，礦物元素對不同來源的乳及乳制品具有良好的鑒別能力。除了乳類的產(chǎn)地來源，泌乳期也可能影響乳類中礦物元素的含量[18-20]。Miciński等[21]及Malacarne等[22]通過測定乳中礦物元素含量，發(fā)現(xiàn)不同礦物元素在不同泌乳階段含量不同。綜上，國內(nèi)外基于礦物元素技術(shù)的泌乳期及產(chǎn)地溯源研究，大多針對奶酪及特種家畜乳等樣品，相關(guān)研究的樣本量及礦物元素測定較少，不同研究對泌乳期階段有不同劃分，導(dǎo)致不同泌乳階段對樣品中礦物元素的含量影響不同。此外，產(chǎn)地不同導(dǎo)致同規(guī)格或者同類型的牛奶價(jià)格產(chǎn)生較大差異，易出現(xiàn)摻假、造假及以次充好等相關(guān)安全問題。

本研究初步探討泌乳期3個(gè)階段對牛奶中12種元素(鈉、鎂、鉀、鈣、鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅、鍶和鉬)含量的影響。在此基礎(chǔ)上，利用礦物元素含量區(qū)分我國不同地區(qū)的牛奶樣品。通過方差分析和偏最小二乘判別分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并根據(jù)交叉驗(yàn)證結(jié)果區(qū)分牛奶樣品的來源。最后，在確定牛奶樣品來源后獲得影響產(chǎn)地溯源的關(guān)鍵重要性因子(variable importance in the projection, VIP)。本研究利用礦物元素含量分析研究泌乳期不同階段及不同產(chǎn)地對牛奶中營養(yǎng)成分的影響，建立牛奶的產(chǎn)地溯源模型，以期為牛奶在泌乳期不同階段的研究提供思路及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考，并為牛奶產(chǎn)地溯源研究提供理論依據(jù)，以保障乳制品安全及真實(shí)性，保護(hù)廣大消費(fèi)者合法權(quán)益。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從4個(gè)地區(qū)(河北、寧夏、陜西和內(nèi)蒙古)收集泌乳期3個(gè)不同階段(早期：30～90 d，中期：120～180 d，末期：210～270 d)牛奶樣品，并在-20℃條件下冷凍。分別從每個(gè)省的每個(gè)泌乳期各采集10個(gè)乳樣，每個(gè)乳樣50 mL，共計(jì)120個(gè)樣品。牛奶樣品的地理信息如表1所示。

表1 牛奶樣品地理信息表

1.2 材料與試劑

硝酸(色譜純)、氟化氫(色譜純)、甲醇(色譜純)，美國Fisher Scientific；其余試劑均為分析純。所用水均為超純水。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為奶粉(GBW 10017)和雞肉(GBW 10018)，中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所。

1.3 儀器與設(shè)備

防腐烘箱，青島濟(jì)科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；7500系列電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技公司；H1850 臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.4 樣品制備及測定

將50 g牛奶樣品(鮮重)在-20℃條件下冷凍，然后將其在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h并研磨成細(xì)粉。將凍干的牛奶置于離心管中，并以1∶5(g·mL-1)的固液比加入氯仿∶甲醇溶液(2∶1)，振動(dòng)10 min，然后以5 000 r·min-1的速度離心5 min，用移液管移去上清液，重復(fù)此過程2次。離心管用穿孔薄膜密封，放在通風(fēng)櫥中過夜。將樣品凍干并研磨均勻，將0.2 g脫脂干物質(zhì)稱重放置到15 mL聚四氟乙烯消化罐中，向罐中加入0.6 mL硝酸和2 mL氟化氫，在150℃的防腐烘箱中消化12 h后打開蓋子，在120℃的防腐電熱板上將酸蒸發(fā)至接近干燥。將2 mL硝酸加入罐中，并將其置于150℃的防腐烘箱中12 h。最后，將消化罐內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用超純水定容，并通過0.45 μm無機(jī)過濾器進(jìn)行分析。用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀對12種元素(鈉、鎂、鉀、鈣、鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅、鍶和鉬)進(jìn)行分析。用奶粉和雞肉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)牛奶樣品的元素值，對每個(gè)樣品進(jìn)行3次分析，并使用外部標(biāo)準(zhǔn)分析進(jìn)行量化，所有結(jié)果均表示為3次測量的平均值。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)包括鍺、釔、銠和鉑，用于確保儀器的穩(wěn)定性。每當(dāng)內(nèi)標(biāo)物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差高于5%時(shí)，重新測量樣品。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對礦物元素進(jìn)行方差分析，當(dāng)差異顯著時(shí)，進(jìn)行Duncan多重比較以確定區(qū)域間的顯著差異，使用線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)評價(jià)礦物元素值對不同樣品來源的判別效果。利用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行偏最小二乘判別分析(partial least-squares discriminant analysis, PLS-DA)以區(qū)分不同產(chǎn)地的牛奶樣品，并通過計(jì)算礦物元素的重要性以確定影響產(chǎn)地溯源的關(guān)鍵重要性因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 泌乳期不同階段牛奶礦物元素含量差異比較

泌乳期的3個(gè)階段(早期:30～90 d，中期:120～180 d，末期:210～270 d)中12種礦物元素(鈉、鎂、鉀、鈣、鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅、鍶和鉬)的含量見表2。同一泌乳期，常量元素中含量最高的是鉀(16 281～16 922 mg·kg-1)，最低的是鎂(1 182～1 255 mg·kg-1)。微量元素含量最高的是鐵(70.5～74.8 mg·kg-1)，最低的是鉻(107～119 μg·kg-1)。經(jīng)方差分析，12種礦物元素在泌乳期不同階段的含量差異不顯著(P>0.05)。表明在這3個(gè)泌乳階段中，泌乳期對牛奶中的礦物元素含量無影響。

表2 不同泌乳階段牛奶中12種礦物元素含量

2.2 不同產(chǎn)地牛奶礦物元素含量差異比較

圖1顯示4個(gè)地區(qū)牛奶樣品中12種礦物元素(鈉、鎂、鉀、鈣、鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅、鍶和鉬)的含量。方差分析結(jié)果表明，除鉬外，其余11種礦物元素在4個(gè)地區(qū)的牛奶樣品中均存在差異。寧夏地區(qū)牛奶樣品中鈉、鎂、鉀、鈣、鐵及鎳6種礦物元素含量高于其他3個(gè)地區(qū)；內(nèi)蒙古地區(qū)的牛奶樣品中鈦、鉻、錳和鋅含量顯著高于其他3個(gè)地區(qū)；陜西和內(nèi)蒙古的牛奶樣品中鍶含量差異不顯著，但顯著高于其他2個(gè)地區(qū)。河北地區(qū)牛奶樣品中鈉、鎂、鉀、鈦、鉻、錳、鐵、鎳及鍶元素含量顯著低于其他3個(gè)地區(qū)；河北和寧夏地區(qū)牛奶樣品中鋅含量差異不顯著，但顯著低于其他2個(gè)地區(qū)；陜西和內(nèi)蒙古地區(qū)樣品鈣含量差異不顯著，但顯著低于其他2個(gè)地區(qū)。4個(gè)地區(qū)牛奶中含量最高的常量元素是鉀(12 898～22 871 mg·kg-1)，最低的是鎂(879～1 610 mg·kg-1)；河北、寧夏及陜西3個(gè)地區(qū)牛奶含量最高的微量元素是鐵(62～84 mg·kg-1)，內(nèi)蒙古地區(qū)牛奶含量最高的微量元素是鋅(75 mg·kg-1)，4個(gè)地區(qū)含量最低的微量元素是鉻(44～176 μg·kg-1)。

注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的牛奶產(chǎn)地判別分析

為區(qū)分不同產(chǎn)地的牛奶樣品，根據(jù)12種礦物元素含量進(jìn)行偏最小二乘法分析，結(jié)果如圖2所示。4個(gè)地區(qū)的牛奶樣品分別聚類且彼此分離，說明通過礦物元素含量可以區(qū)分4個(gè)地區(qū)的牛奶樣品。4個(gè)地區(qū)牛奶樣品的分類及驗(yàn)證結(jié)果見表3?？傮w正確分類和交叉驗(yàn)證的準(zhǔn)確率結(jié)果分別為95.8%和88.3%，說明利用礦物元素技術(shù)可以對這4個(gè)地區(qū)的牛奶樣品進(jìn)行有效判別。用SIMCA 14.1軟件進(jìn)一步對4個(gè)地區(qū)牛奶樣品進(jìn)行分析，獲得分類礦物元素的重要性因子(圖3)。結(jié)果表明，牛奶中的鍶、鉻、鋅及錳4種礦物元素是具有較高貢獻(xiàn)的重要性因子(>1)，因此可以通過測定上述4種礦物元素識(shí)別河北、寧夏、陜西和內(nèi)蒙古4個(gè)地區(qū)牛奶樣品的來源。

圖2 4個(gè)地區(qū)牛奶樣品的PLS-DA圖

圖3 4個(gè)地區(qū)牛奶樣品分類礦物元素的重要性因子

表3 4個(gè)地區(qū)牛奶樣本的分類和正確驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

在本研究中，選擇泌乳期的3個(gè)階段(早期:30～90 d，中期:120～180 d，末期:210～270 d)對牛奶中的12種礦物元素含量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明泌乳期不同階段中的牛奶礦物元素特征不具有差異性，與前人研究結(jié)果不同[18, 23]，但與Aumeistere等[24]報(bào)道的結(jié)果相似，這可能是由于泌乳期階段的劃分不同導(dǎo)致對礦物元素含量的影響不同，也可能是由于品種或物種差異造成的影響不同[25]。本研究中同一泌乳期含量最高的常量元素是鉀，最低的是鎂[18]，微量元素含量最高的是鐵，與孟慶翔[26-27]對肉牛飼料中的礦物元素含量研究結(jié)果一致。

在前期研究基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)研究了地區(qū)對牛奶中礦物元素含量的影響，結(jié)果表明不同產(chǎn)地可顯著影響牛奶中礦物元素含量，與高玎玲[28]及郭秀秀[29]的研究結(jié)果一致。本研究中寧夏地區(qū)牛奶樣品的鈉和鉀含量高于其他3個(gè)地區(qū)，這可能與奶牛的飼養(yǎng)方式有關(guān)[30]。雖然微量元素(鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅、鍶及鉬)在體內(nèi)的含量較低，但可通過奶牛的飲食與飲水轉(zhuǎn)移到牛奶中，而奶牛的飲食及飲水與當(dāng)?shù)氐牡刭|(zhì)和土壤特征有關(guān)[31]。Chen等[32]對全國29個(gè)省、市及自治區(qū)22種土壤環(huán)境元素的背景值進(jìn)行研究調(diào)查，發(fā)現(xiàn)寧夏地區(qū)土壤中鎂、鈣及鎳元素的含量明顯高于內(nèi)蒙古、河北及陜西地區(qū)，與本研究中牛奶礦物元素在以上不同地區(qū)的含量結(jié)果一致。

雖然國內(nèi)外基于礦物元素技術(shù)的乳制品產(chǎn)地溯源研究相對較多[33-35]，但大多集中于歐洲地區(qū)，且多數(shù)是針對奶酪進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究，關(guān)于牛奶的產(chǎn)地溯源研究相對較少[36]。本研究利用礦物元素技術(shù)并通過偏最小二乘判別分析法，對牛奶樣品進(jìn)行產(chǎn)地溯源，結(jié)果顯示對4個(gè)地區(qū)有良好的區(qū)分效果，說明牛奶中礦物元素的含量具有獨(dú)特的產(chǎn)地環(huán)境特征，可作為牛奶產(chǎn)地溯源的重要變量參數(shù)。4個(gè)地區(qū)的牛奶樣品分類及判別結(jié)果顯示原始分類準(zhǔn)確率為95.8%，交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率為88.3%，說明礦物元素技術(shù)可以有效鑒別牛奶樣品的來源。通過計(jì)算4個(gè)地區(qū)12種礦物元素的重要性因子篩選出鑒別牛奶樣品產(chǎn)地的關(guān)鍵重要性因子(鍶、鉻、鋅及錳)，這4種礦物元素反映了奶牛生長的地域地理狀態(tài)，其含量與4個(gè)地區(qū)奶牛生長的地域及飲水環(huán)境密切相關(guān)[37-39]，是識(shí)別河北、寧夏、陜西及內(nèi)蒙古地區(qū)牛奶樣品的指示因子，代表著這4個(gè)牛奶產(chǎn)地的礦物指紋特性，尤其是飲水環(huán)境，4個(gè)地區(qū)飲用水中的鍶元素含量遠(yuǎn)高于國家標(biāo)準(zhǔn)[37-38，40]，奶牛通過飲水影響牛奶中的鍶含量，與周雪巍[41]的研究結(jié)果一致。綜上所述，產(chǎn)地對乳品中的礦物元素含量有影響，且乳品中的礦物元素特征具有地域差異性，因此可以利用礦物元素技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)判別模型對牛奶進(jìn)行產(chǎn)地溯源。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明泌乳期3個(gè)階段(早期:30～90 d，中期:120～180 d，末期:210～270 d)不影響牛奶中12種礦物元素的含量，不同泌乳階段的劃分對礦物元素含量的影響不同，在同一泌乳階段中，鉀元素含量最高，鉻元素含量最低；而4個(gè)不同的地區(qū)(河北、寧夏、陜西及內(nèi)蒙古)則影響牛奶中除鉬元素外的11種礦物元素(鈉、鎂、鉀、鈣、鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅及鍶)含量。此外，本研究在牛奶的產(chǎn)地溯源研究中獲得了良好的交叉驗(yàn)證結(jié)果，并得到了鍶、鉻、鋅和錳4個(gè)可以判別河北、寧夏、陜西及內(nèi)蒙古牛奶樣品的關(guān)鍵重要性因子。說明利用礦物元素技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)判別模型對牛奶進(jìn)行產(chǎn)地溯源是可行的，這為牛奶的礦物元素?cái)?shù)據(jù)庫及產(chǎn)地溯源研究提供了有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)，也為牛奶在泌乳期不同階段的研究提供了相關(guān)思路。