賈小霞 馬 勝 齊恩芳 呂和平 劉 石 黃 偉 李 掌 曲亞英

(1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所/甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070;2國家種質(zhì)資源渭源觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅 渭源 748201)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)營養(yǎng)豐富，用途廣泛，不僅關(guān)系糧食安全，而且是解決貧困的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。近年來，隨著國家馬鈴薯“主糧化”戰(zhàn)略的推進(jìn)，其在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中的地位更加突出，種植面積不斷擴(kuò)大。然而，隨著馬鈴薯大面積規(guī)?；N植，雜草防治成為馬鈴薯生產(chǎn)面臨的一個(gè)重要問題[2]。由于人工除草勞動(dòng)強(qiáng)度大、成本高，施用除草劑已成為各國馬鈴薯生產(chǎn)的一項(xiàng)重要除草措施[3-4]。目前，常用的馬鈴薯專用除草劑有二甲戊靈、乙草胺、精異丙甲草胺等苗前土壤處理劑和嗪草酮、砜嘧磺隆、精喹禾靈等莖葉處理劑[5]。但土壤處理劑受環(huán)境因素影響較大，而且不能見草施藥，在用藥上存在很大的局限性和盲目性，藥效較難保證[6]；莖葉處理劑均為選擇性除草劑，每種除草劑只對(duì)少數(shù)雜草有效，沒有兼除多種雜草的作用，除草效率低、成本高[7]。廣譜滅生性除草劑殺草譜廣，除草效率高，但容易對(duì)作物產(chǎn)生藥害，往往導(dǎo)致植株變態(tài)，甚至死亡、絕產(chǎn)絕收，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。因此，培育抗廣譜滅生性除草劑的馬鈴薯新品種一直是各國育種工作者的努力方向之一[9]，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供了有效途徑。

生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的廣譜滅生性除草劑——草銨膦，作用靶標(biāo)是植物氮代謝中的關(guān)鍵酶——谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)[10]。Bar基因來源于土壤吸水鏈霉菌，其編碼的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin acetyhransferase，PAT)蛋白可使草銨膦的自由氨基乙酰化而失去對(duì)GS活性的抑制作用，表現(xiàn)出草銨膦抗性[11]，該基因已成功轉(zhuǎn)入水稻[12]、油菜[13]、小麥[14]等多種作物，且自1999年美國批準(zhǔn)轉(zhuǎn)Bar基因水稻LLRICE06和LLRICE62商業(yè)化種植以來，已有多個(gè)轉(zhuǎn)Bar基因水稻品種被美國、加拿大、俄羅斯等多個(gè)國家批準(zhǔn)食用和飼用，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[15]。然而人們擔(dān)心草銨膦的作用靶標(biāo)單一，在抗性作物連作時(shí)容易誘導(dǎo)雜草產(chǎn)生抗藥性，可能產(chǎn)生超級(jí)雜草。常規(guī)除草劑在抗草銨膦等轉(zhuǎn)基因馬鈴薯田的合理使用可以有效延緩和治理抗性雜草的產(chǎn)生，因此，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗除草劑馬鈴薯對(duì)非靶標(biāo)除草劑的敏感性及其安全性具有重要的理論和實(shí)踐意義。

在馬鈴薯轉(zhuǎn)基因研究中，已有多項(xiàng)研究以Bar基因作為篩選標(biāo)記篩選陽性轉(zhuǎn)化材料[16-17]，但關(guān)于所選材料的除草劑抗性研究鮮見報(bào)道。前期，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含有Bar基因和抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREB1A基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入多個(gè)隴薯系列馬鈴薯品種中[18]，經(jīng)抗性篩選獲得了具有穩(wěn)定草銨膦抗性的馬鈴薯材料[19-20]。隨著我國產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)基因監(jiān)管政策的調(diào)整，轉(zhuǎn)基因耐廣譜滅生性除草劑作物的推廣種植可能將是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的必然選擇和確保我國糧食安全的戰(zhàn)略需求[21-22]。為了明確轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯環(huán)境釋放的安全性，有必要對(duì)抗性材料進(jìn)行靶標(biāo)、非靶標(biāo)除草劑及環(huán)境安全性評(píng)價(jià)。因此，本研究以轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯為研究材料，在田間對(duì)靶標(biāo)除草劑草銨膦和非靶標(biāo)除草劑草甘膦、滅草松、11%砜嘧磺隆·精喹禾靈的雜草防效及安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為轉(zhuǎn)Bar基因抗草銨膦馬鈴薯的商業(yè)化種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯材料由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室提供。供試41%草甘膦異丙胺鹽水劑，由美國孟山都公司生產(chǎn)；供試480 g·L-1滅草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾靈可分散油懸浮劑，由山東中禾化學(xué)有限公司生產(chǎn)；供試10%草銨膦水劑和HD400背負(fù)式電動(dòng)噴霧器(藥劑噴施器具)，由河北威遠(yuǎn)生化農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州試驗(yàn)地隔離區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，即于馬鈴薯出苗后20 d時(shí)，分別將推薦劑量為中劑量的草甘膦，推薦劑量為高劑量的滅草松、11%砜嘧磺隆·精喹禾靈可分散油懸浮劑和草銨膦加入450 kg·hm-2的自來水中(表1)，混勻后按小區(qū)定向莖葉噴施田間雜草。每個(gè)處理3次重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積16 m2，行距60 cm，株距33 cm，小區(qū)間設(shè)1 m的隔離帶。

表1 除草劑組分及有效成分含量

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 除草劑對(duì)馬鈴薯藥害和對(duì)雜草的防效調(diào)查 分別于藥后7和14 d，肉眼觀察馬鈴薯表型，觀察除草劑是否對(duì)馬鈴薯造成藥害，如有藥害發(fā)生，藥害癥狀和藥害級(jí)別參照余桂容等[23]的方法進(jìn)行描述。分別于藥后30和45 d，調(diào)查除草劑對(duì)雜草的防效，調(diào)查方法和防效計(jì)算均參照賈小霞等[19]的方法。

1.3.2 馬鈴薯生長指標(biāo)測(cè)定 噴施除草劑后30和45 d時(shí)，每小區(qū)按對(duì)角線選擇6株馬鈴薯，測(cè)量株高、莖粗和根莖葉鮮干重。采用卷尺測(cè)量株高，即植株地上莖基部到生長點(diǎn)的高度(cm)；采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺緊貼土壤層從植株的正面和側(cè)面兩個(gè)方向測(cè)量莖直徑，用平均值表示植株的莖粗(mm)[24]；用電子稱測(cè)定根莖葉鮮干重(g)，即采挖整株馬鈴薯，測(cè)完鮮重(g)后，于105℃殺青30 min，80℃烘至恒重后，測(cè)定干重(g)。

1.3.3 成熟期馬鈴薯產(chǎn)量、品質(zhì)和除草劑殘留測(cè)定 成熟期(10月8日)，每小區(qū)按對(duì)角線收獲6株馬鈴薯，同時(shí)收集根際土壤測(cè)定除草劑殘留。收獲的塊莖混合測(cè)定產(chǎn)量后求平均值計(jì)算株平均產(chǎn)量(g)，然后用清水沖洗表面泥土等雜質(zhì)，一部分用于淀粉、干物質(zhì)、粗蛋白、還原糖和維生素C等品質(zhì)性狀含量的測(cè)定，一部分用于除草劑殘留的測(cè)定。

品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)都參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，其中淀粉含量參照NY/T 11-1985[25]采用旋光法測(cè)定；干物質(zhì)含量參照GB 5009.3-2016[26]采用直接干燥法測(cè)定；粗蛋白含量參照GB 5009.5-2016[27]采用凱氏定氮法測(cè)定；還原糖含量參照 GB/T 5009.7-2016[28]采用直接滴定法測(cè)定；維生素C含量參照 GB/5009.86-2016[29]采用熒光法測(cè)定。馬鈴薯塊莖和土壤中的草銨膦殘留參照GB 23200.108-2018[30]采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS)法檢測(cè)，滅草松、砜嘧磺隆和精喹禾靈均參照BS EN 15662∶2018[31]采用LC-MS法檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)采用 Microsoft Office Excel 2010整理分析；采用DPSV 3.01軟件進(jìn)行單因素方差(one-way analysis，ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析；差異顯著性采用Duncan’s 法分析。所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同除草劑處理下馬鈴薯藥害分析

由表2可知，施藥后7和14 d時(shí)，T1、T2、T3和T4處理區(qū)馬鈴薯生長正常，與清水對(duì)照(CK)一致，無藥害癥狀出現(xiàn)；而T5處理區(qū)馬鈴薯受害嚴(yán)重，施藥后7 d時(shí)莖葉萎蔫黃化，14 d時(shí)植株全部干枯死亡。由于施藥后14 d時(shí)T5處理區(qū)馬鈴薯全部死亡，因此，后續(xù)試驗(yàn)不對(duì)其進(jìn)行分析。

表2 噴施不同除草劑7和14 d時(shí)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯藥害統(tǒng)計(jì)

2.2 不同除草劑對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯生長的影響

施藥后30和45 d時(shí)，各藥劑處理區(qū)和對(duì)照區(qū)馬鈴薯一樣，都能正常生長，表型上沒有出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，說明試驗(yàn)劑量的藥劑對(duì)馬鈴薯沒有產(chǎn)生明顯藥害。由表3可知，藥后30 d，不同處理區(qū)的馬鈴薯各生長指標(biāo)差異較大，各處理的平均株高為56.18～63.74 cm，其中T4與T3處理的平均株高無顯著差異，但T4處理的平均株高顯著高于T2、T1和CK；平均莖直徑為9.23～10.03 mm，其中T4、T3和T2處理間無顯著差異，但顯著高于CK和T1，且CK與T1無顯著差異；根莖葉平均株鮮重為187.61～240.17 g，其中T4顯著高于T3和其他處理，T3顯著高于T2、T1和CK，T2、T1和CK間無顯著差異；根莖葉平均株干重為19.24～28.04 g，其中T4顯著高于其他處理，T3顯著高于T2、T1和CK，T2顯著高于CK，T1與CK間無顯著差異。

表3 施藥后30 d時(shí)不同除草劑對(duì)抗草銨膦馬鈴薯生長的影響

由表4可知，藥后45 d，各處理的平均株高為60.69～66.21 cm，其中T4與T3之間無顯著差異，但顯著高于T1和CK；平均莖直徑為9.37～11.01 mm，其中T4、T3和T2處理間無顯著差異，但顯著高于T1和CK，T1與CK間無顯著差異；根莖葉平均株鮮重為200.57～267.37 g，其中T4>T3>T2，且各處理間差異顯著，T1與CK間無顯著差異，但顯著低于其他處理；根莖葉平均株干重為21.57～32.34 g，各處理間的差異水平同平均株鮮重。成熟期單株產(chǎn)量從高到低依次為T4>T3>T2>T1>CK，且各處理間的差異均達(dá)到顯著水平。

表4 施藥后45 d時(shí)不同除草劑對(duì)抗草銨膦馬鈴薯生長和成熟期單株產(chǎn)量的影響

2.3 不同除草劑對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯塊莖營養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表5可知，成熟期各處理馬鈴薯塊莖的平均淀粉含量為15.80%～16.07%，平均粗蛋白含量為2.39%～2.56%，平均還原糖含量為0.46%～0.49%，平均維生素C含量為14.67～15.48 mg·100g-1，平均干物質(zhì)含量為18.44%～19.15%，各指標(biāo)在所有處理間有差異，但均未達(dá)到顯著水平，說明試驗(yàn)劑量的除草劑對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯的塊莖營養(yǎng)品質(zhì)無顯著影響。

表5 不同除草劑對(duì)馬鈴薯塊莖營養(yǎng)品質(zhì)的影響

2.4 不同除草劑對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草的防治效果

試驗(yàn)田雜草主要有闊葉雜草薺菜(Capsellabursa-pastorisL.Medic.)、苣荬菜(SonchusbrachyotusDC)、灰藜(ChenopodiumglaucumL.)、反枝莧(AmaranthusretroflexusL.)、馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)和田旋花(ConvolvulusarvensisL.)，禾本科雜草野燕麥(AvenafatuaL.)、狗尾草(SetairaviridisL.Beauv.)、旱稗[Echinochloahispidula(Retz)Nees.]和牛筋草(EleusineindicaL.Gaertn.)。由于雜草種類較多，雜草防效按照闊葉雜草和禾本科雜草兩大類進(jìn)行計(jì)算。

如表6所示，藥后30 d，T1、T2、T3和T4對(duì)闊葉雜草的株防效分別為10.46%、32.22%、58.56%和 86.22%，對(duì)禾本科雜草的株防效分別為6.38%、72.06%、84.43%和94.06%；藥后45 d，T1、T2、T3和T4對(duì)闊葉雜草的株防效分別為19.26%、30.51%、54.39%和82.51%，鮮重防效分別為25.85%、48.27%、64.56%和86.72%；對(duì)禾本科雜草的株防效分別為3.87%、70.38%、82.23%和92.38%，鮮重防效分別為4.09%、76.78%、85.01%和92.78%?？梢钥闯?，除T1處理對(duì)禾本科雜草的株防效和鮮重防效都低于7%外，其他處理對(duì)闊葉雜草和禾本科雜草均有明顯的防治效果，且兩類雜草的株防效和鮮重防效從高到低的順序一致，都表現(xiàn)為T4>T3>T2>T1，且各處理間的差異均達(dá)到極顯著水平。

表6 不同除草劑對(duì)轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯田間雜草的防治效果

2.5 馬鈴薯塊莖和土壤中除草劑殘留分析

由表7可知，成熟期各處理區(qū)馬鈴薯塊莖和土壤中滅草松、精喹禾靈、砜嘧磺隆和草銨膦的檢測(cè)值均小于檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果為未檢出，表明試驗(yàn)劑量的各藥劑均不會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留危害。

表7 農(nóng)藥殘留檢測(cè)結(jié)果

3 討論

綜合考慮除草劑對(duì)馬鈴薯生長安全性及對(duì)雜草的防除效果，非靶標(biāo)除草劑草甘膦(T5)在殺滅雜草的同時(shí)，對(duì)馬鈴薯產(chǎn)生了嚴(yán)重藥害，致使馬鈴薯植株干枯死亡、絕產(chǎn)絕收，受害率達(dá)100%。草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型、非選擇滅生性除草劑[32-33]，雖然具有高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，但它對(duì)馬鈴薯同樣具有滅殺作用，不能應(yīng)用于轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田。通過比較各藥劑處理下馬鈴薯的株高、莖粗、植株鮮/干重、單株產(chǎn)量和品質(zhì)等特性與噴施清水對(duì)照(CK)間的差異，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)劑量的非靶標(biāo)除草劑滅草松(T1)、11%砜嘧磺隆·精喹禾靈(T2)以及二者的復(fù)配劑(T3)對(duì)馬鈴薯生長過程安全無藥害，但各處理對(duì)雜草的防效和對(duì)馬鈴薯的增產(chǎn)效果差異較大。當(dāng)以滅草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草時(shí)，滅草松對(duì)雜草的防治效果較差，藥后30 d，推薦劑量的高劑量(T1)對(duì)闊葉和禾本科雜草的株防效分別僅為10.46%和6.38%，雖然馬鈴薯的前期長勢(shì)與噴施清水對(duì)照(CK)無顯著差異，但還是大大減少了對(duì)馬鈴薯養(yǎng)分吸收的影響，成熟期馬鈴薯單株產(chǎn)量較對(duì)照增加了16.87%，這與劉巍等[34]采用有效成分1 440 g·hm-2的滅草松處理普通馬鈴薯田間雜草時(shí)，藥后30 d闊葉雜草的株防效為98.17%的研究結(jié)果差異較大，這種差異可能是由于不同地區(qū)的雜草種類和氣候條件差異以及除草劑的使用時(shí)間不同所致，仍需進(jìn)一步研究。本研究中，藥后45 d，11%砜嘧磺隆·精喹禾靈的高劑量(T2)對(duì)闊葉雜草的株、鮮重防效分別為30.51%和48.27%，對(duì)禾本科雜草的株、鮮重防效分別為70.38%和76.78%，馬鈴薯單株產(chǎn)量較噴施清水對(duì)照(CK)增加42.12%，較滅草松單獨(dú)處理(T1)增加21.61%。11%砜嘧磺隆·精喹禾靈和滅草松的復(fù)配劑對(duì)雜草的防效顯著高于二者單獨(dú)使用時(shí)的防效，藥后45 d，推薦劑量高劑量的復(fù)配劑(T3)對(duì)闊葉雜草的株、鮮重防效較滅草松單獨(dú)處理(T1)分別提高35.13和38.71個(gè)百分點(diǎn)，較11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理(T2)分別提高23.88和16.29個(gè)百分點(diǎn)；對(duì)禾本科雜草的株、鮮重防效較滅草松單獨(dú)處理(T1)分別提高78.36和80.92個(gè)百分點(diǎn)，較11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理(T2)分別提高11.85和8.23個(gè)百分點(diǎn)；馬鈴薯單株產(chǎn)量較噴施清水對(duì)照(CK)增加58.39%，較滅草松單獨(dú)處理(T1)增加35.52%，較11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理(T2)增加11.44%。綜上可知，雖然滅草松、砜嘧磺隆和精喹禾靈已在馬鈴薯田獲得登記應(yīng)用，但單獨(dú)處理的雜草防效均不及復(fù)配劑，這與吳仁海等[35]的研究結(jié)論一致。

通過比較草銨膦處理下馬鈴薯的株高、莖粗、植株鮮/干重、單株產(chǎn)量和品質(zhì)等特性與噴施清水對(duì)照(CK)間的差異，發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)除草劑草銨膦的高劑量對(duì)馬鈴薯生長過程安全無藥害，這與賈小霞等[19]的研究結(jié)果一致；對(duì)闊葉雜草的株、鮮重防效都高于82.51%，對(duì)禾本科雜草的株、鮮重防效都高于92.38%，均顯著高于T1、T2和T3；單株產(chǎn)量較噴施清水對(duì)照(CK)增加67.40%，較滅草松單獨(dú)處理(T1)增加43.24%，較11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理(T2)增加17.79%，較滅草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾靈復(fù)配劑處理(T3)增加5.6%。相比滅草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理，用二者的復(fù)配劑與草銨膦輪換防治轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草，可以達(dá)到較理想的防治效果。

從藥劑在馬鈴薯塊莖及土壤中的殘留分析結(jié)果看，各處理馬鈴薯和土壤中滅草松、精喹禾靈和砜嘧磺隆的檢測(cè)值均小于0.01，草銨膦在馬鈴薯和土壤中的檢測(cè)值均小于0.10，都小于檢測(cè)限，可以認(rèn)為不會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留危害，說明所有處理對(duì)薯塊和環(huán)境都是安全的。

本研究僅選擇了靶標(biāo)除草劑草銨膦和3種非靶標(biāo)除草劑，只對(duì)推薦劑量的高劑量對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草的防效及食用和環(huán)境安全性進(jìn)行了分析，而關(guān)于這些除草劑更高劑量和其他新型除草劑的使用安全性還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用草銨膦推薦劑量的高劑量可以高效防治轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草，減少雜草對(duì)馬鈴薯生長的影響，顯著提高生產(chǎn)效率。但為了防止轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯連作時(shí)，因靶標(biāo)除草劑草銨膦作用單一而誘導(dǎo)雜草產(chǎn)生草銨膦抗性的風(fēng)險(xiǎn)，建議用有效成分1 440 g·hm-2的滅草松和99 g·hm-211% 砜嘧磺隆·精喹禾靈復(fù)配劑與草銨膦輪換防治雜草。