王 斌 武春爽 湯冰琳 王 光 何金明 曲姍姍 朱世江,*

(1 韶關學院英東生物與農業(yè)學院, 廣東 韶關 512005；2 華南農業(yè)大學園藝學院, 廣東 廣州 510642)

MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)轉錄因子存在于所有真核生物中，因序列中含有MYB保守結構域而得名[1]。MYB轉錄因子氨基酸序列中含有1～4個串聯(lián)的MYB保守域，每個保守域大約含有52個氨基酸殘基[2]。根據保守域數量，MYB轉錄因子可分為四種類型，即4R-MYB(含有4個MYB保守域)，3R-MYB(R1R2R3-MYB)，2R-MYB(R2R3-MYB)和1R-MYB(MYB like)，每個MYB保守域都由1個螺旋-轉角-螺旋結構構成[3]。四種類型的MYB在植物中均有發(fā)現，而R2R3-MYB的數量最多。例如，在水稻(OryzasativaL.)和擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)基因組中，分別有56.77%和70.05%的MYB轉錄因子是R2R3-MYB[4]；玉米(ZeamaysL.)基因組中的R2R3-MYB轉錄因子超過200個[5]。

在玉米中最先克隆出MYB基因，目前的研究表明，植物基因組中均含有MYB基因。近幾年的研究表明，MYB轉錄因子是植物最大的轉錄因子家族之一[6]。比如，水稻、擬南芥[4]和番茄(SolanumlycopersicumL.)[7]基因組中分別含有155、197和121個MYB基因。作為植物最大的轉錄因子家族之一，MYB轉錄因子的生物學功能十分豐富，其功能主要涉及調控次生代謝產物合成[8-9]、形態(tài)建成[10]、細胞周期[11-12]、生長發(fā)育[13]和信號轉導[14]等。同時，MYB還廣泛參與對多種生物和非生物脅迫的響應以及對脅迫作出抗性反應[15-16]。

采后果蔬由于脫離母體，失去養(yǎng)分供應來源，只能依靠自身的呼吸代謝來維持正常的生命活動[17]。各種生理代謝活動會不斷消耗自身養(yǎng)分，加速采后果蔬的衰老進程，縮短貯藏壽命。而通過降低采后果蔬自身和貯藏環(huán)境的溫度，可降低采后果蔬呼吸強度，抑制病原微生物的生長速度，減少乙烯釋放，從而抑制自身代謝活力、延長貯藏期[18]。但原產于熱帶或亞熱帶的果蔬在低溫貯藏條件下易產生冷害[19-20]。黃瓜(CucumissativusL.)原產于熱帶亞熱帶地區(qū)，對低溫十分敏感，在10℃及以下溫度貯藏時即會發(fā)生冷害[21]。冷害使得果皮細胞受損，導致抗病性降低，在貯藏期很容易被致病菌侵染，發(fā)生嚴重的次生病害，導致嚴重的經濟損失[22]。因此，通過分子育種培育耐冷性強的黃瓜品種，是提高采后黃瓜耐冷性的根本手段。因此，挖掘低溫響應MYB基因并初步探究其生物學功能，能為黃瓜的品種改良提供重要候選基因資源。目前，在擬南芥、水稻和番茄等模式植物中關于MYB轉錄因子的研究較多，而對于果菜類蔬菜耐冷相關MYB轉錄因子的分離及其調控機制仍有待深入研究。

植物富甘氨酸蛋白(glycine-rich proteins, GRPs)。該蛋白是一類具有豐富甘氨酸重復序列的蛋白質，根據結構特征，將其分為4個亞家族[23]。其中，第四亞家族的GRP氨基酸序列的N端含有RNA識別域(RNA recognition motifs, RRM)、冷休克結構域(cold-shock domain)或鋅指結構(zinc fingers)等保守結構域[24]。富甘氨酸RNA結合蛋白(glycine-rich RNA-binding protein, GR-RBP)屬于GRP的第四亞族，其結構中至少含有1個RRM結構域[25]。本試驗前期的研究結果證實，低溫誘導的CsGR-RBP3表達上調是黃瓜果實耐冷性增強的重要原因[25-26]。前期分析啟動子序列發(fā)現，該基因的啟動子序列中含有豐富的MYB結合元件，表明MYB可能調控CsGR-RBP3表達。但目前MYB轉錄因子通過CsGR-RBP3調控采后黃瓜耐冷性的分子機理仍不清楚。因此，本研究通過生物信息學的方法，鑒定與CsGR-RBP3表達模式一致的MYB基因，以采后黃瓜為材料克隆CsMYB62基因全長序列，并采用分子生物學的方法，初步探究CsMYB62調控CsGR-RBP3表達的潛在機制?？寺〔㈣b定調控CsGR-RBP3表達的MYB轉錄因子，對于豐富MYB調控網絡以及解析植物誘導耐冷性的分子機理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與菌株

供試黃瓜品種為翠夏，采自廣東省臺山市當地農場(22°03′37.63″N，112°56′35.83″E)。黃瓜果實在園藝成熟度時進行采收，采收后立即運回廣東省果蔬保鮮重點實驗室。

大腸桿菌DH 5α、BL21(DE3)和農桿菌GV3101感受態(tài)細胞購于上海唯地生物技術有限公司。

1.2 采后黃瓜低溫處理和轉錄組測序

挑選大小、成熟度基本一致，無病蟲害的黃瓜果實作為供試材料，分成3組，每組代表1個重復，每重復包含20根黃瓜果實。每個重復單獨用聚乙烯薄膜塑料袋包裹后，放置在5℃恒溫培養(yǎng)箱中處理72 h。取樣時間點為處理期間的0、6、12、24、48和72 h，取果皮作為分析樣品，液氮速凍并保存在-80℃冰箱備用。

選取處理0、12和72 h 3個時間點，進行轉錄組測序。轉錄組測序試驗委托百邁客生物科技有限公司(北京)完成，具體方法和步驟見文獻[27]。用差異倍數(fold change, FC)和顯著水平兩個參數篩選差異表達基因，閾值設定為：log2(FC)>2，且Q<0.05?；虻谋磉_量用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段數(fragments per Kilobase per Million, FPKM)值表示，在百邁客公司的云平臺(http://www.biocloud.net/siyouyun?utm_source=triggermail)分析差異表達基因的共表達趨勢。共表達趨勢分析采用K均值聚類法，將相同表達趨勢的mRNA劃分為一個數據集，并對該數據集作表達模式圖，所用距離測度為歐氏距離。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃瓜CsMYB62基因的克隆 使用北京天根生化科技有限公司的植物總RNA提取試劑盒(產品編號：DP441)提取黃瓜果皮總RNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，用NanoOne超微量紫外分光光度計(杭州佑寧儀器有限公司)測定濃度。之后使用上海翊圣生物科技有限公司的反轉錄試劑盒(產品編號：11141ES60)合成第一鏈cDNA?？俁NA提取和cDNA合成按照試劑盒說明進行。

根據轉錄組測序預測的開放閱讀框(open reading frame, ORF)，設計特異性全長引物，引物序列見表1。以黃瓜果皮cDNA為模板，使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的高保真DNA聚合酶(產品編號：P502)擴增CsMYB62全長序列。擴增完后在產物的3′端加A尾，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物。

將目的條帶切膠回收，并連接到pMD 18-T載體上，轉化DH 5α感受態(tài)細胞。將轉化重組質粒后的DH 5α大腸桿菌涂布在含有氨芐霉素的LB固體平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性單克隆菌落，加至PCR反應液中，進行PCR擴增反應。PCR反應體系為20 μL：正反向引物各1 μL，2×Taq PCR Star Mix 10 μL和無菌水 7 μL，單菌落1 μL。反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸26 s，35個循環(huán)。2×Taq PCR StarMix(產品編號：A012)購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。

將成功轉化重組載體的單菌落送至生工生物工程有限公司(廣州分公司)測序。使用DNAMAN軟件比對測序序列與基因組中公布的序列。

1.3.2 生物信息學分析 使用NCBI數據庫的CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)預測保守結構域，利用在線工具WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分析保守結構域氨基酸保守性，通過Nine Amino Acids Transactivation Domain 9aa TAD Prediction Tool(https://www.med.muni.cz/9aaTAD/index.php)在線工具預測CsMYB62的轉錄激活域。

運用ExPASy ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析理化性質，利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列多重比對，并以MEGA 7.0中的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.3 CsMYB62蛋白亞細胞定位觀察 將CsMYB62全長(不含終止密碼子)連接在pCAMBIA 2300-GFP載體的KpnⅠ酶切位點處，構建亞細胞定位重組質粒。用于構建重組載體的引物信息見表1。重組載體轉化DH 5α感受態(tài)細胞，并經PCR擴增和測序驗證后，采用冷凍法轉化GV3101農桿菌感受態(tài)細胞，操作方法見感受態(tài)使用說明書。

使用真空滲透法將含有重組質粒的GV3101農桿菌注射入煙草葉片的背面細胞。農桿菌與煙草葉片共培養(yǎng)72 h后，使用德國ZEISS公司的正置熒光顯微鏡檢測GFP熒光在煙草葉片細胞中的分布。

1.3.4 qRT-PCR檢測 使用上海翊圣生物科技有限公司的qRT-PCR檢測試劑盒(產品編號：11201ES03)和美國Bio-Rad公司的qRT-PCR儀檢測基因表達。具體反應體系為20 μL：cDNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，PCR Mix 10 μL和RNase free water 7 μL。反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸26 s，40個循環(huán)。所用引物見表1。

1.3.5 pGEX-4T-1-CsMYB62融合載體構建、融合蛋白表達和純化 將pGEX-4T-1載體在EcoRⅠ酶切位點處單酶切，使用上海生工生物工程有限公司的即用型無縫克隆試劑盒(產品編號：B632219)，將CsMYB62全長序列插入線性化載體中，構建pGEX-4T-1-CsMYB62融合表達載體。重組載體轉化DH 5α，之后進行菌液PCR和測序驗證，以保證序列的準確性。構建重組載體所用引物見表1。

之后將重組載體轉化表達菌株BL21(DE3)，誘導CsMYB62-GST融合蛋白表達。使用上海生工生物工程有限公司的GST重組蛋白純化試劑盒[GST-Sefinose(TM)kit](產品編號：C600327)純化融合蛋白，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3.6 EMSA分析 在探針的3′端使用biotin生物素標記探針，探針由生工(上海)生物工程有限公司合成并標記，探針信息見表2。將純化后的CsMYB62蛋白與探針在室溫條件下孵育20 min后，按照上海碧云天生物技術有限公司的EMSA/Gel-Shift試劑盒(產品編號：GS009)操作說明進行。

表2 探針信息

1.3.7 雙熒光素酶報道基因試驗 將CsGR-RBP3啟動子片段(ATG上游-235 bp～-464 bp)構建到pGreenⅡ 0800-LUC 載體上，作為報告基因[28]，將CsMYB62的基因全長重組到pGreenⅡ 62 SK 載體上作為效應基因，以空載體作為對照，載體構建引物信息見表1。

采用真空滲透法將含有效應基因和報告基因的農桿菌GV3101共轉化煙草葉片背面細胞，共培養(yǎng)72 h，使用上海翊圣公司的雙熒光素酶檢測試劑盒(產品編號：11402ES60)和美國Thermo公司的多功能化學發(fā)光儀，同時檢測轉基因煙草葉片的螢火蟲熒光素酶(luciferase, LUC)和海腎熒光素酶(renilla luciferase, REN)的發(fā)光值，通過計算LUC/REN的比值來反映CsMYB62對CsGR-RBP3啟動子的轉錄激活活性。

1.4 數據分析

使用Excel 2016軟件記錄、整理和分析數據，并進行繪圖制表等工作。使用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件采用單因素方差分析法檢驗樣品間以及處理時間點間的差異顯著性，使用不同的小寫字母標注數據間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 低溫處理對黃瓜果實CsMYB62和CsGR-RBP3表達的影響

CsGR-RBP3啟動子中含有5個潛在的MYB轉錄因子結合位點，表明MYB轉錄因子可能調控CsGR-RBP3表達。為鑒定可能調控CsGR-RBP3表達的MYB轉錄因子，利用轉錄組數據進行了差異表達基因的共表達網絡趨勢分析。結果顯示，共有282個差異表達基因的表達趨勢與CsGR-RBP3一致(圖1-A)。其中，鑒定到7個MYB基因在低溫處理72 h后，表達量增加。進一步采用qRT-PCR法分析這7個MYB基因在整個低溫處理期間的表達模式，發(fā)現在整個低溫處理期間，僅有CsMYB62與CsGR-RBP3的表達模式一致，其表達量均隨處理時間增加(圖1-B、C)。由此推測CsMYB62可能是調控CsGR-RBP3表達的候選轉錄因子。

注: 不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。

2.2 CsMYB62基因克隆與生物信息學分析

為進一步分析CsMYB62的功能，從黃瓜果皮中克隆了該基因的cDNA全長序列。從PCR產物的電泳圖中可以看出，目的產物片段長度小于1 000 bp。而黃瓜CsMYB62的cDNA全長為834 bp，說明可能克隆到黃瓜CsMYB62基因(圖2-A)。之后將該PCR產物回收，連接到pMD 18-T載體上，構建克隆載體。測序結果顯示，目的PCR產物序列與基因組[Cucumber(Chinese Long)v3 Genome, http://www.cucurbitgenomics.org/organism/20]中公布的CsMYB62(基因組中的登錄號：CsaV3_1G003920)序列一致(圖3)，表明成功克隆到CsMYB62全長。CsMYB62基因定位在基因組的1號染色體上，基因結構中含有3個外顯子(圖2-B)。

注：M：DNA分子量標準(DL2000)；1：CsMYB62基因的PCR產物；橢圓形長條表示外顯子，橫線表示內含子。

如圖3所示，黃瓜果實CsMYB62基因編碼序列由834 bp核苷酸組成，編碼277個氨基酸殘基。使用ExPASy-ProtParam在線工具分析了黃瓜CsMYB62蛋白的基本特性，CsMYB62蛋白的理論分子量和等電點分別為31.19 kDa和5.9。在277個氨基酸殘基中，帶負電荷和正電荷的氨基酸殘基總數分別為33和28個，其中，絲氨酸比例最高，達15.2%。

圖3 黃瓜CsMYB62基因核苷酸和氨基酸序列

CsMYB62蛋白與甜瓜(Cucnmismelo)CmMYB24蛋白(XP_008453409.1)的氨基酸序列同源性最高，為90.97%。與擬南芥AtMYB62(NP_176999.1)、水稻OsJAMYB(XP_015618000.1)和番茄SlMYB62(XP_004239413.2)的序列同源性介于48.45%～71.53%之間。這5種MYB蛋白的氨基酸序列中均包含1個SANT保守域和1個MYB DNA結合域(圖4-A)，表明其均是典型的R2R3-MYB轉錄因子。

借助WebLogo在線工具分析了黃瓜CsMYB62蛋白與4種其他植物MYB蛋白(甜瓜CmMYB24、擬南芥AtMYB62、水稻OsJAMYB和番茄SlMYB62)的SANT和MYB保守域的氨基酸序列保守性。結果顯示，這5個MYB蛋白的SANT結構域中有33個氨基酸完全一致(圖4-B)，MYB結構域中有36個氨基酸完全一致(圖4-C)，表明不同植物間的SANT和MYB結構域在進化過程中高度保守。

在NCBI數據庫中通過同源比對，找到了28個與黃瓜CsMYB62蛋白同源性較高的MYB轉錄因子，利用MEGA軟件構建這29個MYB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹?？芍?，黃瓜CsMYB62蛋白與其他植物MYB蛋白的進化關系較近(圖5)。其中，黃瓜CsMYB62蛋白與甜瓜CmMYB24蛋白(XP_008453409.1)的親緣關系最近。

注: CsMYB62蛋白及登錄號用黑色方框標出。

2.3 CsMYB62蛋白的亞細胞定位

將CsMYB62全長序列(不含終止密碼子)構建到pCAMBIA 2300-GFP載體上，并導入煙草葉片背面細胞。通過觀察GFP蛋白在煙草細胞中的定位發(fā)現，在煙草葉表皮細胞的細胞質和細胞核中，均觀察到空載的GFP熒光信號，而CsMYB62只在煙草葉片細胞的細胞核中觀察到了熒光信號(圖6)，表明CsMYB62定位在細胞核，是核定位蛋白，符合轉錄因子的定位特性。

圖6 黃瓜CsMYB62蛋白的亞細胞定位

2.4 CsMYB62轉錄因子與CsGR-RBP3啟動子的結合

在CsGR-RBP3開放閱讀框ATG上游啟動子序列的-347～-307 bp之間，含有2個串聯(lián)的MYB結合元件(圖7-A)。為驗證CsMYB62轉錄因子是否能與這2個MYB結合位點結合，開展了凝膠阻滯遷移試驗。結果(圖7-B)顯示，當CsMYB62蛋白與用生物素標記的CsGR-RBP3啟動子探針共同孵育時，檢測到轉錄因子與啟動子的復合物，且競爭性探針影響CsMYB62蛋白與CsGR-RBP3啟動子的結合能力(圖7-B)。表明CsMYB62蛋白能直接與CsGR-RBP3啟動子相結合，從而調控其表達。

注：A：MYB結合位點在CsGR-RBP3啟動子中的位置；B：CsMYB62蛋白與CsGR-RBP3啟動子結合的電泳遷移分析。

2.5 CsMYB62轉錄因子對CsGR-RBP3啟動子的激活活性

使用雙熒光素酶報道基因試驗驗證CsMYB62是否能激活CsGR-RBP3啟動子活性。載體構建示意圖如圖8-A所示，將CsGR-RBP3啟動子序列構建到pGreenⅡ 0800-LUC載體上，作為報告基因。將CsMYB62全長片段構建到pGreenII 62-SK載體上，作為效應基因。雙熒光素酶報道基因試驗的結果(圖8-B)顯示，與對照(SK+pro-LUC)相比，CsMYB62與CsGR-RBP3啟動子共表達(SK-MYB62+ pro-LUC)能夠顯著增強LUC活性，而與pGreenII 0800 LUC空載共表達(SK-MYB62+LUC)不會顯著增加LUC活性。上述結果表明，CsMYB62轉錄因子能在體內與CsGR-RBP3啟動子結合，并增強啟動子活性。

注：A：載體構建示意圖；B：CsMYB62對CsGR-RBP3啟動子的轉錄激活活性；不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。

3 討論

植物GR-RBP的表達受低溫脅迫等多種非生物脅迫因子誘導，在增強植物抗逆性中起重要作用[29]。本研究前期發(fā)現，黃瓜果實CsGR-RBP3表達在低溫處理后上調，該基因的表達與采后黃瓜耐冷性正相關[25-26]，但該基因表達的轉錄調控機理尚不清楚。對啟動子序列的生物信息分析結果發(fā)現，啟動子區(qū)域含有豐富的MYB轉錄因子結合位點，表明MYB轉錄因子可能參與CsGR-RBP3表達的調控。植物R2R3-MYB轉錄因子響應低溫并與耐冷性密切相關，且能直接調控下游基因的表達[30-31]。為鑒定調控CsGR-RBP3表達的轉錄因子，本試驗利用轉錄組測序數據進行了共表達趨勢分析，結果顯示，CsMYB62的表達模式與CsGR-RBP3相似。由此推測CsMYB62轉錄因子可能調控CsGR-RBP3的表達。

本研究的基因表達分析結果證實，CsMYB62能被5℃低溫處理所誘導，且表達量隨處理時間的延長而增加。在玉米、水稻和擬南芥等植物中也報道了相似的結果[32-34]。4℃低溫能迅速誘導玉米ZmMYB31基因的表達，在擬南芥中過表達該基因，能夠顯著提高轉基因植株的超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化物酶活性，從而增強耐冷性[32]。鹽、低溫和干旱脅迫均能顯著上調水稻OsMYB2基因的表達。在水稻中過表達該基因，增強了植物對鹽、低溫和干旱脅迫的耐受性[33]。水稻OsMYB2蛋白定位在細胞核，超表達OsMYB2顯著上調與脯氨酸合成和轉運有關基因的表達，從而增強水稻耐冷性[34]。上述結果表明，CsMYB62是一個低溫響應轉錄因子基因，同時推測其可能在黃瓜果實的低溫應答和耐冷性調控中發(fā)揮重要作用。

克隆是研究目標基因功能的前提和基礎[35]。為進一步分析CsMYB62基因的功能，本研究從黃瓜果皮中克隆到了CsMYB62基因全長序列。黃瓜CsMYB62基因開放閱讀框長度為834 bp，共編碼277個氨基酸殘基。黃瓜CsMYB62蛋白含有SANT和MYB保守結構域，表明CsMYB62是典型的R2R3-MYB轉錄因子。不同植物MYB轉錄因子的SANT和MYB保守域保守性很高、進化關系較近，表明植物R2R3-MYB轉錄因子在進化中高度保守，這可能是植物適應環(huán)境脅迫的重要原因之一。

R2R3-MYB轉錄因子通過直接調控下游基因的表達而發(fā)揮作用[2]。擬南芥AtMYB96蛋白是一個核定位蛋白，且低溫能誘導AtMYB96表達，AtMYB96蛋白通過直接與AtHHP基因的啟動子結合，調控AtHHP表達[36]。蘋果(Malusdomestica)MdMYB88和MYB124能迅速響應低溫處理，增強擬南芥和蘋果愈傷組織抗凍性，且能與MdCSP3和MdCCA1啟動子結合，直接調控MdCSP3和MdCCA1基因的表達[37]。同樣，低溫脅迫能誘導蘋果MdMYB23基因的表達，MdMYB23蛋白通過直接與MdCBF1與MdCBF2啟動子結合，激活MdCBF1與MdCBF2基因的表達[38]。本研究中，CsMYB62定位在細胞核，且能直接綁定到CsGR-RBP3啟動子上，證實了CsMYB62直接調控CsGR-RBP3表達。同時，CsMYB62與CsGR-RBP3在低溫處理期間的表達模式一致，表達量均隨低溫處理時間的延長而增加，CsMYB62蛋白能增強CsGR-RBP3啟動子活性，表明CsMYB62通過激活CsGR-RBP3表達，調控采后黃瓜耐冷性。CsMYB62是否與其他轉錄因子(如NAC、MYB、MYC、bHLH等)相互作用，從而調控CsGR-RBP3表達，以及CsMYB62和CsGR-RBP3是否同時受其他轉錄因子的調控，尚需進一步研究。

4 結論

本試驗從黃瓜果皮中分離了1個R2R3-MYB轉錄因子CsMYB62。CsMYB62蛋白定位在細胞核，并能與CsGR-RBP3啟動子結合，激活CsGR-RBP3啟動子活性。以上結果表明，CsMYB62通過直接調控CsGR-RBP3的表達，從而調控采后黃瓜的耐冷性。本研究結果豐富了MYB轉錄因子的調控網絡，加深了對黃瓜果實誘導耐冷性的轉錄調控機制的認識。