王思凡，蔡曉雪，孟祥霄，萬會花，曹 雪，米要磊，徐艷琴，孫 偉*，陳偉強(qiáng)*

大麻遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

王思凡1，蔡曉雪2，孟祥霄1，萬會花1，曹 雪1，米要磊1，徐艷琴2，孫 偉1*，陳偉強(qiáng)1*

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 中藥鑒定與安全性評估北京市重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100700 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004

自從烏拉圭、加拿大和美國部分州將中藥“火麻仁”的基原植物大麻合法化以來，工業(yè)大麻的市場價值逐年提高。高市值推動大麻基礎(chǔ)研究迅猛發(fā)展，其遺傳轉(zhuǎn)化研究也實(shí)現(xiàn)了質(zhì)的突破。目前，發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麻毛狀根轉(zhuǎn)化、根癌農(nóng)桿菌和納米材料介導(dǎo)的大麻瞬時轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的基因沉默和大麻穩(wěn)定轉(zhuǎn)化均已實(shí)現(xiàn)，但是穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化效率仍然不高。而建立高效的大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系，不但可加速大麻分子生物學(xué)的研究，還可用于大麻新品種的創(chuàng)制。綜述大麻遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展，以期為深入開展大麻遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

大麻；遺傳轉(zhuǎn)化；瞬時轉(zhuǎn)化；穩(wěn)定轉(zhuǎn)化；基因沉默；納米材料

大麻L.又稱線麻、火麻，是隸屬于大麻科（Cannabinaceae）大麻屬的一年生草本植物，原產(chǎn)于中亞地區(qū)[1]。大麻的纖維可用于紡織或造紙，種子可以榨油或制造油漆，果實(shí)“火麻仁”可入藥[2]。因此，大麻具有極高的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值。在藥用方面，大麻雌性花器官或腺毛中的大麻素在止痛、抗炎、緩解焦慮以及治療癲癇等方面療效顯著[3-4]。大麻素屬于萜酚類化合物，目前已經(jīng)分離并鑒定出的大麻素有100多種，其中含量較高的有四氫大麻酚、大麻二酚和大麻環(huán)萜酚等[5-6]。四氫大麻酚具有鎮(zhèn)痛、抗驚厥、止吐等作用，而更為人們熟知的是其強(qiáng)烈的成癮性[7-8]。因此，四氫大麻酚的應(yīng)用以及四氫大麻酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.3%（干質(zhì)量）大麻的種植都受到法律法規(guī)的嚴(yán)格管控[9]。大麻二酚同樣具有抗炎、治療癲癇、抗焦慮及抑郁的作用[10-11]。但大麻二酚不具有精神活性，因此，以大麻二酚為主的大麻的種植以及商業(yè)化應(yīng)用在國內(nèi)外的管理都更為寬松[9,12]。目前，大麻二酚被廣泛開發(fā)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品等多個行業(yè)，2020年市場規(guī)模約為70億美元，預(yù)計2028年將超過180億美元[13]。大麻品種多數(shù)是雌雄異株、異花授粉。其性別以及外界環(huán)境因素均影響著大麻的多種性狀及藥用成分含量[14]，因此，解析大麻次生代謝物質(zhì)的合成過程和調(diào)控機(jī)制，以及與大麻發(fā)育相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對提高大麻重要活性物質(zhì)的生產(chǎn)具有重要意義。另外，大麻的繁殖和選育需要大量的篩選工作，但目前常規(guī)雜交育種存在性狀分離嚴(yán)重、雌雄株鑒別耗時長、效率低下等問題[15]。我國2018年種植大麻約18 600 hm2，但主要以工業(yè)大麻為主。而藥用大麻的種質(zhì)資源匱乏，主要依賴進(jìn)口。由于進(jìn)口藥用大麻受到嚴(yán)格管控以及種質(zhì)價格昂貴等多種問題，無法滿足目前國內(nèi)科研和生產(chǎn)需求[12]。因此，改善大麻的種質(zhì)資源，選育高藥用成分的品種，對于大麻的工廠化生產(chǎn)至關(guān)重要。而上述工作，均需依靠一套穩(wěn)定且高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

植物遺傳轉(zhuǎn)化作為一項現(xiàn)代生物技術(shù)，在品種改良、基因功能解析方面有著廣泛的應(yīng)用。通過DNA重組技術(shù)將目的基因?qū)氲侥康纳锏幕蚪M中，產(chǎn)生可預(yù)期的、定向的遺傳改變。借助轉(zhuǎn)基因的手段，可以有效地提高植物的多種農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，并可對植物次生物質(zhì)代謝的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。大麻素作為植物的次生代謝產(chǎn)物，通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改變其代謝途徑，增加有效成分含量，是優(yōu)化其種質(zhì)資源的有效手段。另外，遺傳轉(zhuǎn)化也有助于解析大麻素生物合成的調(diào)控機(jī)制，可為異源生物合成重要大麻素奠定分子基礎(chǔ)。目前，植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化方法包括生物學(xué)方法、物理方法和化學(xué)方法3大類。生物學(xué)方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[16]、病毒載體法[17]、沾花法和花粉管通道法[18]；物理方法包括基因槍法[19]、顯微注射法[20]、電激法[21]和納米材料法[22]；化學(xué)方法包括聚乙二醇介導(dǎo)法[23]和脂質(zhì)體介導(dǎo)法[24]等。大麻僅有農(nóng)桿菌法、病毒載體法、納米材料法和聚乙二醇法的相關(guān)報道（圖1），其中又以農(nóng)桿菌法使用最為廣泛。

根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌是植物遺傳轉(zhuǎn)化使用最為廣泛的農(nóng)桿菌，其分別含有腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒和根誘導(dǎo)質(zhì)粒[25]。2種質(zhì)粒中均含有具有特異序列的轉(zhuǎn)化-DNA（transfer-DNA，T-DNA）區(qū)。當(dāng)農(nóng)桿菌感染植物受傷的部位時，腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)?；蚋T導(dǎo)質(zhì)粒virulence（）區(qū)域的基因可以被植物分泌的酚類和糖類物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)，這些基因編碼的蛋白質(zhì)將T-DNA區(qū)域從腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)?；虬l(fā)根誘導(dǎo)質(zhì)粒上面切割下來，以單鏈DNA的形式輸送到植物細(xì)胞中[26]。進(jìn)入細(xì)胞后的T-DNA可以穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞基因組，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化；或游離于細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)瞬時表達(dá)，隨后被核酸酶降解。根據(jù)外源DNA能否穩(wěn)定整合到植物基因組并遺傳給后代這一特征，大麻遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果分為瞬時轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化2類。因此，本文以轉(zhuǎn)化結(jié)果為切入點(diǎn)，對目前大麻的不同轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行介紹，以期為深入研究大麻的遺傳轉(zhuǎn)化提供可參考的依據(jù)。

1 瞬時轉(zhuǎn)化

目前，大麻瞬時轉(zhuǎn)化方法相對成熟，不論是農(nóng)桿菌真空滲透侵染法[27-28]、納米材料介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化[29]或病毒介導(dǎo)的基因沉默研究[30]均已在不同大麻品種中實(shí)現(xiàn)。而農(nóng)桿菌真空滲透法較其他方法而言具有成本低、操作簡便、實(shí)施門檻低等特點(diǎn)，具有更普遍的適用性。

圖1 大麻遺傳轉(zhuǎn)化重要事件時間軸

Fig.1 Timeline of important events intransformation

1.1 農(nóng)桿菌真空滲透侵染法

真空滲透法利用大氣負(fù)壓將植物細(xì)胞間隙內(nèi)的空氣排除，在真空釋放階段，農(nóng)桿菌進(jìn)入細(xì)胞間隙，侵染植物細(xì)胞。Sorokin等[27]利用根癌農(nóng)桿菌EHA105對4種大麻Candida CD-1、Nightingale、Green Crack CBD和Holy Grail與CD-1的雜交種進(jìn)行侵染。將含有β-葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuronidase，）基因的農(nóng)桿菌懸浮于MS液體培養(yǎng)基中至600 nm處的吸光度值為0.6，并加入100 μmol/L乙酰丁香酮，600 mm Hg（1 mm Hg＝133 Pa）抽吸10 min后轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基培養(yǎng)。隨后利用染色在超過50%（染色陽性/轉(zhuǎn)化樣品總數(shù)）的樣品中檢測到基因的瞬時表達(dá)。4種品種中，Nightingale轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)70%。Deguchi等[28]測試了不同處理方法對瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響，在農(nóng)桿菌重懸液MS中額外加入了10 mmol/L 2-(-嗎啉代)乙磺酸和2%葡萄糖。8 kPa抽吸5～15 min后，進(jìn)一步進(jìn)行22.5 kHz的超聲處理。在8種大麻，包括雌雄同株的工業(yè)大麻Fedora 17、Felina 32、Ferimon、Futura 75、Santhica 27和USO 31，雌雄異株的工業(yè)大麻CRS-1和CFX-2的根、莖、葉、花和腺毛中均實(shí)現(xiàn)了或綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，）基因的瞬時表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，0.015% Silwett-L-77、5 mmol/L維生素C和0.05% Pluronic F-68可顯著提高瞬時轉(zhuǎn)化效率。另外，農(nóng)桿菌GV3101相較于EHA105和LBA4404也具有更高的瞬時轉(zhuǎn)化效率。除此之外，不同品種的大麻瞬時轉(zhuǎn)化效率也不盡相同。其中，CRS-1轉(zhuǎn)化效率最高，F(xiàn)elina 32效率最低。除此之外，還構(gòu)建了八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，）基因的RNA干涉載體，并利用真空法瞬時表達(dá)RNA干涉載體，成功降低了基因的表達(dá)量。盡管其在大麻當(dāng)中的干涉效率不高，但依然為研究大麻次生代謝產(chǎn)物在花中的合成途徑及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子作用方式提供了新的驗證方法。

1.2 其他

除了利用農(nóng)桿菌外進(jìn)行植物瞬時轉(zhuǎn)化外，基因槍法、聚乙二醇法、納米材料法和病毒載體等也可實(shí)施瞬時遺傳轉(zhuǎn)化。目前，針對藥用植物大麻，納米材料法和病毒載體法已有報道。如Schachtsiek等[29]使用棉花皺葉病毒對大麻Finola的后代進(jìn)行了病毒誘導(dǎo)的基因沉默研究。棉花皺葉病毒基因組含有2個單鏈DNA（DNA-A和DNA-B）[30]。DNA-A編碼基因組復(fù)制相關(guān)蛋白AL1、抗沉默蛋白AL2、復(fù)制相關(guān)蛋白AL3、沉默抑制子AL4和外殼蛋白AR1。DNA-B編碼遷移蛋白BL1和BR1。目的基因片段插入到DNA-A的基因中后，將含有目的片段的DNA-A和DNA-B通過基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式導(dǎo)入植物細(xì)胞，可引起植物系統(tǒng)性感染，進(jìn)一步引起RNA誘導(dǎo)的基因沉默[31]。該方法成功沉默了大麻的基因。但沉默效率偏低，僅在20%左右。

Ahmed等[32]首次報道了運(yùn)用納米材料進(jìn)行大麻遺傳轉(zhuǎn)化的實(shí)驗。報道選用了二氧化硅包被的金納米粒子作為載體，將聚乙烯亞胺與含有羧基的、二氧化硅包被的納米粒子共價結(jié)合。聚乙烯亞胺帶有正電荷，帶有負(fù)電荷的DNA可以通過靜電吸附作用與納米材料結(jié)合。將結(jié)合有DNA的納米材料注射到1個月齡大麻葉的背面，5 d后觀測到報告基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)外源基因的瞬時表達(dá)。

雖然目前大麻瞬時轉(zhuǎn)化已可實(shí)現(xiàn)，但是總體轉(zhuǎn)化效率仍然偏低。如在Sorokin等[27]的報道中，陽性大麻幼苗中僅少數(shù)細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)染色，與模式植物煙草比較，轉(zhuǎn)化效率仍然十分低。雖然Deguchi等[28]通過添加表面活性劑、抗氧化劑和增加細(xì)胞機(jī)械損傷等方法進(jìn)一步提高了瞬時轉(zhuǎn)化效率，但是，在特殊組織細(xì)胞例如雌性花器官和成熟葉片的轉(zhuǎn)化效率仍然很低。全病毒載體雖然可以對植物造成系統(tǒng)性侵染，具有相對較高的瞬時表達(dá)效率，并有機(jī)會將目的性狀傳遞到后代[33]。但是，全病毒載體所能承載外源DNA大小有限，很難用于長片段DNA的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炑芯?。除此之外，全病毒載體也易造成生物安全隱患，很難通過環(huán)境釋放進(jìn)行大面積應(yīng)用[34]。而納米材料由于其特殊性和相對較高的造價，并不適合常規(guī)實(shí)驗室使用。

除了選擇對農(nóng)桿菌菌種和大麻基因型進(jìn)一步的篩選，以及抗氧化劑基、表面活性劑和機(jī)械損傷的應(yīng)用之外，合理使用基因沉默抑制子也有望進(jìn)一步提高瞬時轉(zhuǎn)化效率?；虺聊种谱邮且活悂碓从诓《镜?、具有抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默功能的特殊蛋白。瞬時轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的RNA會引起植物細(xì)胞適應(yīng)性防御反應(yīng)，從而被植物細(xì)胞識別并通過RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體降解[35]。沉默抑制子可通過結(jié)合siRNA或沉默復(fù)合物中的蛋白來阻止植物細(xì)胞對外源RNA的降解[36]，從而提高外源基因的表達(dá)水平。來源于番茄叢矮病毒的基因是目前使用較為廣泛的沉默抑制子[37]，其在煙草瞬時轉(zhuǎn)化中可顯著提高瞬時轉(zhuǎn)化效率[38]。因此，在大麻瞬時轉(zhuǎn)化載體中引入沉默抑制子有望進(jìn)一步提高瞬時轉(zhuǎn)化效率。

雖然目前大麻瞬時轉(zhuǎn)化效率不高，但是，瞬時轉(zhuǎn)化仍可以幫助研究人員在大麻細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大麻基因功能研究、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、蛋白互作或在大麻細(xì)胞內(nèi)瞬時生物合成大麻次生代謝物質(zhì)。在本物種細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行上述實(shí)驗，得到的實(shí)驗結(jié)果相較于異源生物體具有更高的可信度。另外，利用瞬時轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行可遺傳的基因組編輯已經(jīng)在植物中實(shí)現(xiàn)[39]，因此，利用瞬時轉(zhuǎn)化方法獲得穩(wěn)定編輯的大麻新種質(zhì)資源也是未來大麻遺傳轉(zhuǎn)化的發(fā)展方向之一。

2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化

穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的外源基因會整合到植物基因組，并隨目標(biāo)植物基因組復(fù)制，進(jìn)而將轉(zhuǎn)基因性狀遺傳到后代。目前植物最常用的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法有發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化。雖然以上3種方法均可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，但發(fā)根農(nóng)桿菌只能獲得毛狀根組織，毛狀根可以進(jìn)行離體培養(yǎng)和擴(kuò)繁，但不能進(jìn)一步分化生成完整植株。而根癌農(nóng)桿菌和基因槍轉(zhuǎn)化的愈傷組織或外植體通過分化、出芽、生根等組織培養(yǎng)過程，有機(jī)會再生為完整轉(zhuǎn)基因植株，從而可通過有性繁殖將轉(zhuǎn)基因性狀傳遞到后代。但是，不同物種或基因型的愈傷組織或外植體的再生條件和能力完全不同。目前，大麻發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化均已實(shí)現(xiàn)。

2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

Wahby等[40]測試了9種發(fā)根農(nóng)桿菌和3種根癌農(nóng)桿菌對5個大麻品種的侵染效率，是迄今為止唯一1篇關(guān)于大麻發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的報道。5個大麻品種包括用于生產(chǎn)纖維的雌雄異株品種Futura 77、Delta-llsosa、Delta 450和種植于摩洛哥北部的雌雄同株藥用大麻品種CAN0111和CAN0221。研究人員對5 d齡幼苗的下胚軸、子葉節(jié)、子葉、初生葉和下胚軸、子葉、初生葉的外植體進(jìn)行了侵染。研究還發(fā)現(xiàn)，不論使用完整幼苗或是外植體，下胚軸都是侵染效率最高的組織；農(nóng)桿菌前處理時，誘導(dǎo)基因表達(dá)所使用的誘導(dǎo)劑濃度對侵染效率的影響不大，僅使用20 μmol/L乙酰丁香酮即可達(dá)到理想的侵染效率；所有發(fā)根農(nóng)桿菌均可誘導(dǎo)幼苗產(chǎn)生毛狀根，其中R1606的侵染效率最高，達(dá)98%；發(fā)根農(nóng)桿菌和不同品種大麻組合產(chǎn)生的毛狀根均可進(jìn)行離體培養(yǎng)；根癌農(nóng)桿菌侵染后5～8 d便可產(chǎn)生結(jié)瘤，結(jié)瘤效率在不同菌種和大麻品種間無明顯區(qū)別，但結(jié)瘤的生長速度明顯不同。同樣，結(jié)瘤也可用于體外離體培養(yǎng)。

目前，常用的毛狀根方法主要包括直接接種法、外植體接種法和原生質(zhì)體接種法。直接接種法是將發(fā)根農(nóng)桿菌直接涂抹或注射到外植體中，使傷口處直接長出毛狀根。外植體接種法是將外植體切成一定的大小，用一定濃度的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后進(jìn)行共培養(yǎng)，再經(jīng)過篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，最終獲得毛狀根。原生質(zhì)體接種法與外植體接種法相似，也需要對原生質(zhì)體進(jìn)行侵染，共培養(yǎng)及篩選。同外植體接種法和原生質(zhì)體接種法相比較而言，直接接種法不需要對大麻進(jìn)行原生質(zhì)體或外植體培養(yǎng)，一般2～3周便可獲得毛狀根組織。發(fā)根農(nóng)桿菌在侵染植物后能夠誘導(dǎo)其產(chǎn)生大量毛狀根。誘導(dǎo)出的毛狀根可以進(jìn)行離體培養(yǎng)，且生長速度快，已逐漸應(yīng)用到基因工程及品種改良等多個領(lǐng)域[41]。如大麻毛狀根轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)很成熟，當(dāng)前需要解決的難點(diǎn)是如何實(shí)現(xiàn)毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)。另外，毛狀根轉(zhuǎn)化雖然可以獲得穩(wěn)定整合的外源基因，但是大麻素主要積累在雌性花器官中，大麻根中并無證據(jù)表明可以積累大麻素類物質(zhì)。因此，在根中進(jìn)行大麻素合成或調(diào)控基因的功能研究并不一定可行。獲得完整轉(zhuǎn)基因植株仍然是目前大麻遺傳轉(zhuǎn)化的重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。

2.2 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

Mackinnon等[42]首次報道了2種工業(yè)大麻Fedora 19和Felina 34的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，以抗除草劑基因為篩選標(biāo)記基因，以多聚半乳糖醛酸酶抑制酶基因為目的基因，運(yùn)用農(nóng)桿菌侵染根尖的方式成功獲得了完整轉(zhuǎn)基因大麻，且轉(zhuǎn)基因大麻表現(xiàn)出灰霉病菌抗性。該報道是首例大麻遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗報道，雖然報道中并無詳細(xì)的遺傳轉(zhuǎn)化操作過程，但其借鑒了棉花[43]和矮牽牛花[44]的遺傳轉(zhuǎn)化方法。棉花、矮牽?；ㄅc大麻都是雙子葉植物，報道中引用的棉花和矮牽?；ǖ倪z傳轉(zhuǎn)化方法幾近相同，均使用了LBA4404農(nóng)桿菌侵染莖尖外植體，篩選標(biāo)記基因選用（）基因啟動子驅(qū)動的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neomycin phosphotransferase II，）。

Feeney等[45]報道了大麻的組織培養(yǎng)和原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗，但未能獲得再生的完整轉(zhuǎn)基因植株。該報道選取了4個大麻品種。其中，Uniko-B和Kopolti是用于生產(chǎn)纖維的雌雄異株工業(yè)大麻，Anka和Felina 34是用于生產(chǎn)纖維和種子的雌雄同株大麻。大麻不同組織部位進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L 2,4-二氯苯氧乙酸和1 μmol/L激動素的MB培養(yǎng)基（含有大量和微量元素的MS培養(yǎng)基、B5維他命、0.1 g/L肌醇、3%蔗糖、8 g/L瓊脂粉、高溫高壓滅菌前pH 5.8）可有效將Felina和Uniko的不同外植體誘導(dǎo)去分化為愈傷組織。但不同的外植體產(chǎn)生的愈傷組織具有不同的擴(kuò)繁能力。其中，由莖、葉和葉柄產(chǎn)生的愈傷組織擴(kuò)繁能力強(qiáng)，由子葉產(chǎn)生的愈傷組織擴(kuò)繁能力弱。除來源于Uniko的愈傷組織外，其他3個品種的愈傷組織均可有效形成懸浮細(xì)胞系。在此基礎(chǔ)上，使用EHA101農(nóng)桿菌和磷酸甘露糖異構(gòu)酶（Phosphomannose isomerase，）篩選標(biāo)記基因?qū)nka的懸浮系細(xì)胞系進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。使用了擬南芥泛素啟動子，該基因在植物細(xì)胞中可將甘露糖轉(zhuǎn)化為植物碳源。因此，含有基因的細(xì)胞可以在僅含有甘露糖為碳源的培養(yǎng)基中存活，而不含有的細(xì)胞由于不能將培養(yǎng)基中的甘露糖轉(zhuǎn)化為碳源而死亡[46]。最終，利用愈傷組織基因組DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Southern DNA印跡分析證明，其在大麻懸浮細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。

大麻根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的突破是在2020年后，Zhang等[47]報道了大麻的遺傳轉(zhuǎn)化和基因組編輯的研究。這是首例含有詳細(xì)遺傳轉(zhuǎn)化方法和基因組編輯方法的報道。首先測試了不同組織器官、基因型和與發(fā)育相關(guān)的調(diào)控基因?qū)υ偕实挠绊?。以云?號為例，研究發(fā)現(xiàn)，開花15 d后采集的未成熟種子的胚性下胚軸的再生能力明顯高于真葉、子葉和下胚軸等外植體，達(dá)到6.12%。不同基因型對再生的影響也十分明顯。在100種測試的基因型中，約20種基因型的再生效率在4%以上。其中，云麻7號和Red Cherry Berry的雜交F2代DMG278具有最高的再生效率，達(dá)7.09%。進(jìn)一步將不同的發(fā)育調(diào)控基因組合導(dǎo)入DMG278進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)、、、或的外植體生芽率比對照組高1.7倍。對DMG278的基因?qū)嵤┝嘶蚓庉?，?shù)據(jù)顯示，從最初的3950個未成熟胚性下胚軸起始，最終獲得4株基因編輯大麻，另有83株的基因編輯呈嵌合狀態(tài)。與此同時，通過過表達(dá)組合，利用農(nóng)桿菌AGL1對未成熟胚性下胚軸進(jìn)行侵染，獲得1株轉(zhuǎn)基因株系。

Galán-ávila等[48]報道了一種更為高效的大麻遺傳轉(zhuǎn)化方法，選用了6種大麻品種，包括雌雄同株品種Ferimon、Felina 32、Fedora 17、Furura 75、USO31和雌雄異株品種Finola。大麻種子消毒后，在含有1.5%蔗糖的1/2 MS半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，無菌狀態(tài)下切取下胚軸或子葉，并對該外植體的再生和根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究。研究還發(fā)現(xiàn)無論是下胚軸或是子葉均可再生出新芽，但僅下胚軸再生的新芽可進(jìn)一步生根；下胚軸和子葉再生芽率分別為53%、18%，其中，26%下胚軸再生芽可誘導(dǎo)生根；不同基因型的大麻下胚軸再生率也不盡相同，其中，F(xiàn)edora 17最高，達(dá)76%，F(xiàn)inola最低，約為36%。

隨后，研究人員選用農(nóng)桿菌LBA4404和雙元載體pBIN19對大麻外植體進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究。載體pBIN19包括1個報告基因和賦予轉(zhuǎn)基因細(xì)胞卡那霉素抗性的篩選標(biāo)記基因。研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)以及在含有100 mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)外植體都會顯著降低外植體再生芽率和再生芽的生根率。其中下胚軸的再生率由平均53%下降為23%，子葉再生芽率由平均18%下降到1%。而再生芽的生根率也由平均26%下降到2.1%。最終，在120株下胚軸外植體再生苗中檢測到6株轉(zhuǎn)基因大麻，2株子葉外植體再生苗均為轉(zhuǎn)基因植株。不同基因型的轉(zhuǎn)化率差別明顯，其中，F(xiàn)utura 75轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)28.6%[48]。

大麻的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，但是相對轉(zhuǎn)化效率仍然不高。物種的基因型、外植體的選擇、外植體處理方式、培養(yǎng)基配方、農(nóng)桿菌菌種、菌種侵染濃度、侵染時長和共培養(yǎng)條件等均會影響植物的遺傳轉(zhuǎn)化效率[49]。下胚軸是目前再生效率最高的外植體。Zhang等[47]和Galán-ávila等[48]采用了不同的轉(zhuǎn)化策略（圖2）。Zhang等[47]運(yùn)用農(nóng)桿菌侵染大麻外植體后，外植體經(jīng)過去分化形成愈傷、再生芽、生根3步產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大麻。Galán-ávila等[48]侵染外植體后，直接將外植體轉(zhuǎn)移至生芽培養(yǎng)基，外植體不經(jīng)過愈傷培養(yǎng)直接生芽。因此，獲得轉(zhuǎn)基因苗花費(fèi)時間更少，轉(zhuǎn)化效率更高，培養(yǎng)基配方也相對簡單，外植體的獲取也更為容易。另外，上述報道分別僅測試了農(nóng)桿菌AGL1和LBA4404，未對其他農(nóng)桿菌進(jìn)行測試。而不同菌種對植物遺傳轉(zhuǎn)化效率具有顯著影響[50]。通過進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，相信在不久的將來，大麻穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率定可進(jìn)一步提高。

圖2 大麻穩(wěn)定轉(zhuǎn)化簡略圖

3 結(jié)語與展望

大麻自古以來便被應(yīng)用于疾病的治療和紡織行業(yè)，但直到2000年才有了第1篇關(guān)于大麻遺傳轉(zhuǎn)化的報道[26]，比最早的植物遺傳轉(zhuǎn)化報道晚13年[16]。截至2021年，僅查詢到10篇有關(guān)大麻遺傳轉(zhuǎn)化的研究報道，且主要集中在2019年之后。而這其中，僅有4篇報道獲得了完整轉(zhuǎn)基因植株[42,47-48,51]，且其中2篇未闡述詳細(xì)的轉(zhuǎn)化過程[42,51]，其余報道均是瞬時轉(zhuǎn)化或毛狀根轉(zhuǎn)化的研究。

隨著對大麻研究的不斷深入，遺傳轉(zhuǎn)化的重要性逐漸凸顯。但目前這些轉(zhuǎn)化方法大多停留在對方法的探究。大量的轉(zhuǎn)化方法或基因組編輯都停留在對特征基因如、等基因上，而對于功能基因的轉(zhuǎn)化驗證幾乎沒有。盡管多種遺傳轉(zhuǎn)化方法被證實(shí)是可行的，但是轉(zhuǎn)化效率在不同載體及不同品種中存在巨大差異。在對特定品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時，還需要進(jìn)行大量的實(shí)驗探究。筆者認(rèn)為，未來大麻遺傳轉(zhuǎn)化研究主要包括以下幾點(diǎn)：（1）提高轉(zhuǎn)化效率，尋找適合于實(shí)驗室培養(yǎng)和高通量轉(zhuǎn)化的大麻品種。利用遺傳轉(zhuǎn)化培育植物新品種一般首先將目的基因?qū)胼^容易轉(zhuǎn)化的實(shí)驗室品種，然后對目的基因的結(jié)構(gòu)、基因組位置、基因拷貝數(shù)、性狀穩(wěn)定性等進(jìn)行評價，進(jìn)而獲得少數(shù)值得繼續(xù)跟蹤的轉(zhuǎn)基因株系。這一過程往往起始于成百上千的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件。因此，開發(fā)適合于高通量轉(zhuǎn)化和實(shí)驗室培養(yǎng)的大麻品種，是利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)培育大麻新品種的前提；（2）開發(fā)適合于大麻轉(zhuǎn)化的重要性狀基因。除了一般抗逆、抗病蟲害等性狀基因的開發(fā)，針對大麻不同用途開發(fā)相應(yīng)的性轉(zhuǎn)基因也是大麻遺傳轉(zhuǎn)化的主要內(nèi)容。如開發(fā)可提高大麻纖維、火麻仔油或大麻素含量的重要性狀基因。（3）利用轉(zhuǎn)基因和基因組編輯技術(shù)，針對性的提高或降低大麻特定次生代謝產(chǎn)物，也是未來大麻遺傳轉(zhuǎn)化的研究方向之一。如利用基因編輯技術(shù)敲除四氫大麻酚酸合成酶，減少致癮大麻素四氫大麻酚的生物合成等。

盡管大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究仍處于起步階段，但伴隨著大麻使用合法化進(jìn)程的加快，會有越來越多的組織機(jī)構(gòu)開始著手進(jìn)行大麻遺傳轉(zhuǎn)化、基因編輯和新品種培育的研究，必將為未來大麻的生物學(xué)研究和大麻素的獲取帶來更多的技術(shù)手段和方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on genetic transformation of

WANG Si-fan1, CAI Xiao-xue2, MENG Xiang-xiao1, WAN Hui-hua1, CAO Xue1, MI Yao-lei1, XU Yan-qin2, SUN Wei1, CHEN Wei-qiang1

1.Beijing Key Laboratory of Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, Chinese Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2.School of Pharmacy, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

The market value ofthat isthe original plant of Chinese medicine Huomaren () has increased year by year since the legalization in Uruguay, Canada and United States.The increased market value pushes the advance of basic research and genetic transformation of, andhas achievedgreat breakthrough.So far,mediated hairy root transformation,and nanomaterials mediated transient transformation, virus induced gene silencing and stable transformation has been achieved, however, stable transformation efficiency is still lower.Establishment of efficient genetic transformation technology or improving transformation efficiency not only acceleratesmolecular biology research, but also could be applied to create new varieties.Research progress on genetic transformation ofwas reviewed in this paper, in order to provide reference for further study on genetic transformation of.

L.; genetic transformation; transient transformation; stable transformation; gene silencing; nanomaterial

R282.12

A

0253 - 2670(2022)09 - 2882 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.032

2022-01-20

中國中醫(yī)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技人才項目（ZZ14-YQ-028）

王思凡，研究實(shí)習(xí)員，研究方向為中藥生物技術(shù)。E-mail: sfwang@icmm.ac.cn

通信作者：陳偉強(qiáng)，助理研究員，研究方向為中藥生物技術(shù)和藥用植物分子生物學(xué)。E-mail: wqchen@icmm.ac.cn

孫 偉，研究員，研究方向為中藥生物技術(shù)和藥用植物功能研究。E-mail: wsun@icmm.ac.cn

[責(zé)任編輯 崔艷麗]