藺建平 郭建軍 亢和平 張 淵

（金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010111）

0 引言

脈動(dòng)真空滅菌柜由于使用范圍廣、操作安全等優(yōu)點(diǎn)，在制藥行業(yè)中被越來(lái)越多的使用，它不僅可以用于液體類物品的滅菌（對(duì)熱不敏感的溶液如MEM溶液等）、玻璃類用品用具的滅菌（各類血清瓶，取樣瓶，吸管等），還可以用于不銹鋼類用品用具的滅菌（反應(yīng)器附屬用品用具如取樣T閥，離線過(guò)濾器等），而且針對(duì)不同的滅菌物品可以選擇不同的滅菌方式，作為制藥行業(yè)生產(chǎn)線中的重要滅菌設(shè)備，直接影響脈動(dòng)滅菌柜的利用率和企業(yè)單位的直接能源成本。該文針對(duì)某公司所使用型號(hào)中的一種SHINVAXG1.DWT型脈動(dòng)真空滅菌柜的工作原理、不同滅菌方式以及滅菌常用物品時(shí)的注意事項(xiàng)進(jìn)行了詳細(xì)介紹和建議。

1 制藥行業(yè)常用的滅菌方法及微生物滅菌原理

1.1 常用滅菌方法概述

常用滅菌方法如圖1所示。

圖1 常用滅菌方法

1.2 滅菌基本原理

高壓蒸汽滅菌的原理是利用熱蒸汽穿透細(xì)胞使其蛋白質(zhì)等物質(zhì)變性而起到滅菌作用。高溫高壓滅菌，不僅可殺死一般的細(xì)菌、真菌等微生物。對(duì)芽孢、孢子也有殺滅效果，是最可靠、應(yīng)用最普遍的物理滅菌法。主要用于能耐高溫的物品，如培養(yǎng)基溶液、蔗糖奶粉保護(hù)劑等一些溶液及丁基膠塞、搪瓷制品等制藥行業(yè)常用物品的滅菌。

2 設(shè)備使用前關(guān)鍵事項(xiàng)的準(zhǔn)備及要求

2.1 蒸汽

蒸汽的質(zhì)量、壓力直接影響滅菌的效果，所以使用前必須要保證純蒸汽的質(zhì)量和壓力，純蒸汽壓力應(yīng)控制在0.3MPa~0.5MPa，壓力過(guò)低不能保證滅菌程序的順利進(jìn)行；壓力過(guò)高滅菌柜出于安全原因，程序會(huì)自動(dòng)退出，無(wú)法滅菌。打開純蒸汽，在蒸汽進(jìn)入夾層之前，應(yīng)先將管道中的冷凝水排放干凈。

2.2 軟化水

打開軟化水閥，為真空泵和冷凝器用水做準(zhǔn)備。若水源壓力低于0.1MPa，則不能啟動(dòng)設(shè)備運(yùn)行真空泵。 為及時(shí)方便觀察軟化水的壓力，建議在進(jìn)滅菌器的水管道上安裝一塊0~0.6MPa量程的壓力表，便于觀看進(jìn)水壓力。

2.3 滅菌效果檢測(cè)

滅菌效果的檢測(cè)是評(píng)價(jià)其滅菌方法是否合理、滅菌效果是否可靠的必要手段。 常規(guī)的檢測(cè)方式分為化學(xué)檢測(cè)、生物檢測(cè)、物理檢測(cè)三大類。

利用化學(xué)指示劑在一定溫度與作用時(shí)間條件下受熱變色或變形的特點(diǎn)，以判斷是否達(dá)到滅菌所需要求。

該原理是將一定量已知耐熱參數(shù)的耐熱孢子接入被滅菌的物品中，在預(yù)定的滅菌條件下滅菌，以驗(yàn)證滅菌是否達(dá)到要求。常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstereathernophilus，其常規(guī)微生物耐熱參數(shù)值為121℃（1.5min~3.0min）。

物理驗(yàn)證是對(duì)設(shè)備滅菌的溫度、壓力等指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。就是在滅菌時(shí)通過(guò)直觀地觀察滅菌全過(guò)程的時(shí)間、溫度、壓力等相關(guān)參數(shù)，以判斷是否達(dá)到滅菌的要求?；瘜W(xué)檢測(cè)、生物檢測(cè)、物理檢測(cè)這三種方法有著各自不同的目的和意義，因此不可互相替代，應(yīng)互相結(jié)合使用。

3 SHINVAXG1.DWT型脈動(dòng)真空滅菌柜的非脈動(dòng)滅菌（液體程序）和脈動(dòng)滅菌（織物程序）原理及實(shí)例

3.1 脈動(dòng)滅菌（液體程序） 模式下的滅菌及滅菌效果驗(yàn)證

非脈動(dòng)滅菌（液體程序）模式下的滅菌主要是依靠蒸汽的重力，當(dāng)純蒸汽進(jìn)入內(nèi)室時(shí)將內(nèi)室的冷空氣從排氣口逐漸置換出去，使內(nèi)室溫度逐漸升高，盡可能減少溫度死角，從而達(dá)到滅菌目的。

將待高壓驗(yàn)證的MEM溶液分別分裝在帶有棉塞的1.5萬(wàn)mL血清瓶中，每瓶建議分裝5000mL~6000mL，分裝完后用一層硫酸紙和兩層牛皮紙包扎瓶口并裝鍋，滅菌柜建議裝量是單層滿載量的50%~100%。

滅菌溫度：116℃~120℃。滅菌時(shí)間：900s~1800s。置換時(shí)間：2400s。內(nèi)室壓力限度：93kPa~115kPa。

注意事項(xiàng)如下。1）用1.5萬(wàn)mL血清瓶盛裝MEM溶液時(shí)為保證滅菌效果，不宜裝量太多，5000mL~6000mL為宜，瓶口一定要使用透氣的棉塞外加硫酸紙和牛皮紙包扎或使用無(wú)紡布包扎，切勿使用橡膠膠塞密封瓶口，防止因溶液高壓時(shí)瓶?jī)?nèi)液體體積膨脹而發(fā)生爆瓶或蹦塞現(xiàn)象，影響滅菌效果。2）容器內(nèi)液體裝量建議不超過(guò)容器容積的80%。3）使用液體程序?qū)EM溶液進(jìn)行滅菌時(shí)，在排汽結(jié)束后嚴(yán)禁開真空泵抽空，避免發(fā)生爆瓶及液體沸騰。4）液體程序置換時(shí)間的設(shè)定宜長(zhǎng)不宜短，如果置換時(shí)間設(shè)置過(guò)短，將影響MEM溶液的升溫，進(jìn)而可能會(huì)導(dǎo)致溶液滅菌不徹底。5）使用液體程序滅菌時(shí)，滅菌結(jié)束后請(qǐng)確認(rèn)內(nèi)室壓力略低于當(dāng)?shù)卮髿鈮海ńㄗh參考設(shè)備安裝時(shí)廠家設(shè)定的滅菌柜在開門狀態(tài)下屏幕顯示的內(nèi)室壓力值為準(zhǔn)）時(shí)再開門，防止高壓后的液體因內(nèi)外壓差過(guò)大，導(dǎo)致蹦塞或溶液飛濺，影響滅菌結(jié)果。6）滅菌結(jié)束點(diǎn)開門，等真空泵運(yùn)行結(jié)束后請(qǐng)勿立即開大鍋門，等待5min~10min再開大鍋門，要給高壓鍋內(nèi)外留有一定的緩沖時(shí)間。

備注說(shuō)明：下面滅菌效果驗(yàn)證中使用的3種無(wú)菌檢驗(yàn)用培養(yǎng)基分別按各自培養(yǎng)基的使用說(shuō)明配制并分裝在6分管中，每支分裝6mL~8mL，蓋上膠塞經(jīng)116℃，1800s高壓滅菌后無(wú)菌檢驗(yàn)合格備用。

檢驗(yàn)過(guò)程：將高壓滅菌后的MEM溶液（在室溫放置24h，然后移至層流罩（局百環(huán)境）下用5mL無(wú)菌注射器取樣，并分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基2支、 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1支和酪胨瓊脂培養(yǎng)基2支，每支接種0.2mL，分別在25℃（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基和酪胨瓊脂培養(yǎng)基各一支）和37℃（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和酪胨瓊脂培養(yǎng)基各一支）條件下培養(yǎng)7天，每天觀察并記錄檢驗(yàn)結(jié)果。

檢驗(yàn)結(jié)果：觀察7天，無(wú)菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基中均無(wú)菌落生長(zhǎng)，無(wú)菌檢驗(yàn)合格。

檢驗(yàn)過(guò)程：在高壓滅菌后的 MEM 溶液中加10%胎牛血清后貼壁培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，并37℃培養(yǎng)3天，每天觀察細(xì)胞是否染菌。檢驗(yàn)結(jié)果：3天后細(xì)胞生長(zhǎng)良好，顯微鏡鏡檢細(xì)胞輪廓清晰，視野干凈，未見雜菌。

在高壓滅菌MEM溶液時(shí)選擇3個(gè)溫度可能最低的點(diǎn)分別放置生物指示劑,常用的生物指示劑嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstereathernophilus，其常規(guī)微生物耐熱參數(shù)值為121℃（1.5min~3.0min）。一同滅菌，滅菌結(jié)束后將滅菌后的生物指示劑及時(shí)取出并置于56℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h，隨后取出培養(yǎng)后的生物指示劑， 觀察安瓿的內(nèi)容物顏色，并與生物指示劑照片進(jìn)行比較觀察。檢驗(yàn)結(jié)果：48h培養(yǎng)后的生物指示劑顏色呈紫紅色且澄清， 說(shuō)明該滅菌過(guò)程可有效殺滅孢子菌。

重復(fù)上述驗(yàn)證，連續(xù)三次，結(jié)果均符合要求。

3.2 脈動(dòng)滅菌（織物程序） 模式下的滅菌及滅菌效果驗(yàn)證

采用機(jī)械強(qiáng)制脈動(dòng)真空的排除方式， 程序運(yùn)行后，首先進(jìn)入的是脈動(dòng)階段，真空泵運(yùn)轉(zhuǎn)將設(shè)備內(nèi)室氣體及冷凝水經(jīng)抽空閥由真空泵抽出。當(dāng)內(nèi)室壓力達(dá)到脈動(dòng)下限時(shí)，抽空閥關(guān)閉，停止抽空。當(dāng)內(nèi)室壓力達(dá)到脈動(dòng)上限時(shí)，抽空閥再次開啟，又開始抽真空。這樣直至達(dá)到設(shè)定脈動(dòng)次數(shù)。脈動(dòng)次數(shù)達(dá)到后，抽空閥關(guān)閉，真空泵停止。經(jīng)多次抽真空多次注入蒸汽，徹底消除滅菌室內(nèi)的冷點(diǎn)，保證了可靠的滅菌效果。一般一次完整的滅菌程序建議脈動(dòng)三次：一般情況，脈動(dòng)上限為80kPa，脈動(dòng)下限為-80kPa。抽空一次，排出量為80%；當(dāng)抽空二次時(shí)，排出量為96%；當(dāng)抽空三次時(shí)，排出量理論值可達(dá)99.2%。

將待高壓驗(yàn)證的丁基膠塞分別分裝在無(wú)紡布袋中，每袋建議裝500~1000個(gè)，分裝完后用線繩捆扎無(wú)紡布袋口并裝鍋，滅菌柜建議裝量是單層滿載量的50%~100%。

滅菌溫度：121℃；滅菌時(shí)間：3600s；脈動(dòng)次數(shù)：3次；干燥脈動(dòng)次數(shù)：2次；干燥上限設(shè)定：+60kPa；干燥下限設(shè)定：-60kPa；干燥上限等待時(shí)間：60s；干燥下限等待時(shí)間：60s；內(nèi)室壓力限度：11kPa~120kPa。

注意事項(xiàng)如下。1）丁基膠塞用自制的無(wú)紡布袋盛裝，裝量不宜太大，太大會(huì)影響滅菌效果，建議每袋500~1000個(gè)為宜。2）裝鍋時(shí)請(qǐng)勿靠近高壓鍋兩側(cè)的進(jìn)汽口，離進(jìn)汽口太近影響升溫。3）裝鍋時(shí)請(qǐng)勿堵塞前后門附近的排汽口，防止高壓時(shí)冷凝水不能及時(shí)排出而導(dǎo)致開鍋后濕包。4）裝鍋時(shí)盛裝丁基膠塞的無(wú)紡布袋不宜過(guò)于堆積，堆積過(guò)多將影響中間物品的滅菌效果，建議盛裝高壓鍋單層容量的50%~100%。

檢驗(yàn)過(guò)程：將高壓滅菌后的丁基膠塞取一袋置于層流罩（局百環(huán)境）下，無(wú)菌取袋子中央的一個(gè)膠塞置于提前無(wú)菌過(guò)濾備用的10%血MEM溶液瓶中，蓋好瓶蓋上下顛倒搖勻3min~5min，再用5mL無(wú)菌注射器取樣，并分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基2支、 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1支和酪胨瓊脂培養(yǎng)基2支，每支接種0.2ml，分別在25℃（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基和酪胨瓊脂培養(yǎng)基各一支）和37℃（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和酪胨瓊脂培養(yǎng)基各一支）條件下培養(yǎng)7天，每天觀察并記錄。檢驗(yàn)結(jié)果：觀察7天，無(wú)菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基中均無(wú)菌落生長(zhǎng)，無(wú)菌檢驗(yàn)合格。

檢驗(yàn)過(guò)程：用方法一中使用的10%血MEM溶液貼壁培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，并37℃培養(yǎng)3天，觀察細(xì)胞是否染菌。檢驗(yàn)結(jié)果：3天后細(xì)胞生長(zhǎng)良好，顯微鏡鏡檢細(xì)胞輪廓清晰，視野干凈，未見雜菌。

在高壓滅菌丁基膠塞時(shí)選擇3個(gè)溫度可能最低的點(diǎn)分別放置生物指示劑（常用的生物指示劑嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstereathernophilus，其常規(guī)微生物耐熱參數(shù)值為121℃（1.5min~3.0min））。一同滅菌，滅菌結(jié)束后將滅菌后的生物指示劑及時(shí)取出并置于56℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h，隨后取出培養(yǎng)后的生物指示劑， 觀察安瓿的內(nèi)容物顏色，并與生物指示劑照片做比較觀察。檢驗(yàn)結(jié)果：48h培養(yǎng)后的生物指示劑顏色呈紫紅色且澄清，說(shuō)明該滅菌過(guò)程可有效殺滅孢子菌。

重復(fù)上述驗(yàn)證，連續(xù)三次，結(jié)果均符合要求。

4 SHINVAXG1.DWT型脈動(dòng)真空滅菌柜的非脈動(dòng)滅菌和脈動(dòng)滅菌模式的不同對(duì)比

4.1 升溫方式不同

非脈動(dòng)滅菌模式下的程序升溫主要是通過(guò)改變滅菌程序參數(shù)里的置換時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)的，置換是在純蒸汽進(jìn)入內(nèi)室時(shí)通過(guò)重力將內(nèi)室的冷空氣從排汽口逐漸置換出去，使內(nèi)室溫度升高，盡可能減少溫度死角，置換時(shí)間的長(zhǎng)短跟待滅菌物品的負(fù)載量有關(guān)，也跟待滅菌物品的導(dǎo)熱性能有關(guān)，要綜合考慮，根據(jù)負(fù)載量以及內(nèi)室疏水溫度達(dá)標(biāo)的時(shí)長(zhǎng)（溫度達(dá)到 100℃~105℃，且疏水溫度不再波動(dòng)）設(shè)定置換時(shí)間。

采用非脈動(dòng)滅菌模式下的置換方式升溫較緩慢，主要適用于升溫較慢的液體培養(yǎng)基或用硫酸紙和牛皮紙包扎的桶瓶等用品用具的滅菌。

主要是通過(guò)脈動(dòng)真空泵反復(fù)抽至真空實(shí)現(xiàn)的，真空泵運(yùn)轉(zhuǎn)將設(shè)備內(nèi)室氣體及冷凝水經(jīng)抽空閥由真空泵抽出，抽真空后內(nèi)室再注入純蒸汽，從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)室升溫的目的，徹底消除滅菌室內(nèi)的冷點(diǎn)，保證了可靠的滅菌效果。一般情況，脈動(dòng)上限為80kPa，脈動(dòng)下限為-80kPa。抽空一次，排出量為80%；當(dāng)抽空二次時(shí)，排出量為96%；當(dāng)抽空三次時(shí)，排出量理論值可達(dá)99.2%，所以建議一次完整的滅菌程序一般脈動(dòng)三次。

脈動(dòng)式滅菌模式下的脈動(dòng)式升溫速度較快，主要適用于可以快速升溫的物品，例如制藥行業(yè)分裝用丁基膠塞、無(wú)菌服、陶瓷泵等滅菌。

4.2 夾層與內(nèi)室的排汽方式不同

非脈動(dòng)滅菌模式下的液體程序，在滅菌過(guò)程結(jié)束后，慢排疏水閥打開，內(nèi)室蒸汽經(jīng)過(guò)慢排疏水閥慢速排出，使內(nèi)室壓力緩慢下降，從而防止爆瓶和液體過(guò)度沸騰溢出，達(dá)到內(nèi)室排汽的目的。

該模式下的滅菌階段結(jié)束后，程序轉(zhuǎn)入排汽階段。排汽氣動(dòng)閥打開，開始排汽。當(dāng)內(nèi)室壓力下降到一定程度時(shí)，冷凝水閥打開，開始進(jìn)水；真空泵開始運(yùn)轉(zhuǎn)，使排汽速度加快。

5 使用脈動(dòng)真空滅菌柜需要注意的其他事項(xiàng)

需要注意的其他事項(xiàng)如下。1）使用前需要檢查電器箱上方是否有液體滴漏，防止人員觸電。2）關(guān)鍋門時(shí)應(yīng)將門輕輕推至與前封板靠近的位置，再按下關(guān)門按鈕，切勿用力過(guò)猛，防止撞壞行程開關(guān)。3）關(guān)門時(shí)要密切關(guān)注門升降情況，如有異常，立即取消操作（取消操作只需再次按壓同一按鈕），查看故障原因，并排除。4）脈動(dòng)真空滅菌柜屬于特種設(shè)備，相關(guān)人員必須持證上崗。

6 結(jié)語(yǔ)

脈動(dòng)真空滅菌柜在制藥行業(yè)扮演著非常重要的角色，如何規(guī)范、正確、高效地使用該設(shè)備非常重要，每個(gè)基層管理人員和專業(yè)操作人員必須熟練掌握。隨著GMP要求的不斷提高，設(shè)備也在不斷更新?lián)Q代，這就要求設(shè)備使用人員要與時(shí)俱進(jìn)，不斷學(xué)習(xí)和總結(jié)，提高自身的理論水平和專業(yè)技能。