劉蘇翔，高 宇，喬延路，薛建良

(山東科技大學(xué)安全與環(huán)境工程學(xué)院，山東 青島 266590)

環(huán)境中抗生素的污染及生態(tài)效應(yīng)是近年來環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。對(duì)于大多數(shù)的抗生素來說，只有15%能夠被吸收，其余的將通過尿液和糞便排泄到自然生態(tài)系統(tǒng)中，造成環(huán)境污染、危害生物健康[1-4]，全球諸多自然水環(huán)境持續(xù)檢出抗生素的現(xiàn)狀，引起社會(huì)各界廣泛關(guān)注[5]。

本課題以近年來海洋環(huán)境抗生素污染為大背景，探究不同條件下，抗生素對(duì)海洋高效石油降解菌的抗氧化酶活性的影響。通過測(cè)定抗生素對(duì)降解菌的抑菌曲線及測(cè)定3種抗氧化酶SOD，POD，CAT的活性，考察抗生素對(duì)降解菌的毒性效應(yīng)，為了解抗生素對(duì)環(huán)境污染高效降解菌的生態(tài)效應(yīng)提供理論參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)所用菌株為一株從海水中分離出的高效石油降解菌，該菌株通過16SrRNA測(cè)序測(cè)定為銅綠假單胞菌(ZS1)。海水取自中國山東省青島市輸油管道爆炸油污海域(36.07°N，120.38°E)。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

3種抗生素(OTC，EM，SDZ)，購自上海麥克林生化科技有限公司。試驗(yàn)時(shí)，將3種抗生素分別用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的乙醇溶液(其對(duì)細(xì)菌CAT，POD，SOD活性測(cè)定的影響極微弱)逐級(jí)稀釋至所需濃度。LB培養(yǎng)基：蛋白胨質(zhì)量濃度10 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度5 g/L，NaCl質(zhì)量濃度5 g/L，pH 7.4。

1.3 試驗(yàn)方法

(1)抗生素對(duì)ZS1的抑菌曲線的測(cè)定。將含ZS1的菌懸液在30 ℃、140 r/min下?lián)u床培養(yǎng)24 h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液用滅菌的LB培養(yǎng)基調(diào)整至所設(shè)計(jì)的濃度，加入配置好的抗生素溶液，使低濃度(μg/L級(jí))抗生素系列終質(zhì)量濃度為0.05，0.5，5，10，30，60，80 μg/L，高濃度(mg/L級(jí))抗生素系列的終質(zhì)量濃度為0.05，0.25，0.5，1，5，10，25，50 mg/L，同時(shí)設(shè)計(jì)溶劑對(duì)照組(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%乙醇的ZS1菌液)和空白對(duì)照組(含ZS1菌的LB培養(yǎng)基)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

(2)CAT酶活性的測(cè)定。通過紫外比色法[18]測(cè)定CAT的活性。定義吸光度(A240)變化0.01為一個(gè)CAT活性單位，通過紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其在240 nm下的吸光度，每隔1 min讀數(shù)一次，共讀數(shù)3次。

(3)POD酶活性的測(cè)定。通過愈創(chuàng)木酚法[19]測(cè)定POD的活性。定義吸光度(A470)變化0.01為一個(gè)POD活性單位，通過紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其在470 nm波長(zhǎng)下的吸光度，每隔1 min讀數(shù)一次，共讀數(shù)3次。

(4)SOD酶活性的測(cè)定。通過氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法[20]測(cè)定SOD的活性。一個(gè)SOD活性單位定義為SOD抑制NBT光化學(xué)還原50%時(shí)的酶量，通過可見分光光度計(jì)于560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，每組測(cè)定3個(gè)平行樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗生素對(duì)ZS1的抑菌曲線

通過測(cè)量添加不同種類抗生素后ZS1的生長(zhǎng)量，測(cè)定抗生素對(duì)ZS1的抑菌曲線。用抑菌曲線表示抗生素對(duì)ZS1生長(zhǎng)量的抑制程度。不同濃度的OTC，EM，SDZ對(duì)ZS1的抑菌效果見圖1。

由圖1(a)和圖1(b)可以看出：在不同的OTC濃度下，隨著OTC濃度的增加，其對(duì)ZS1的抑制率明顯上升，有顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，但在OTC質(zhì)量濃度低于0.5 μg/L時(shí)，ZS1的增殖能力不會(huì)受到明顯抑制；較高濃度的OTC在長(zhǎng)期作用時(shí)抑菌效果更好，而較低濃度條件下OTC在短期內(nèi)能對(duì)ZS1表現(xiàn)出較好的抑菌效果。具體來看，在高濃度情況下，48 h的抑制率最大達(dá)98.8%，48 h的抑菌率高于24 h的抑菌率，可能是因?yàn)榻佑|時(shí)間短，在此情況下OTC對(duì)ZS1活性的抑制來不及表現(xiàn)。在低濃度情況下，培養(yǎng)24 h時(shí)OTC對(duì)ZS1的抑制率高于培養(yǎng)48 h時(shí)，反映在較長(zhǎng)時(shí)間的低濃度情況下，ZS1對(duì)OTC的抗藥性隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增強(qiáng)。在實(shí)際環(huán)境中較低濃度的OTC在短期內(nèi)能對(duì)ZS1表現(xiàn)出較好的抑菌效果，較高濃度的OTC則在長(zhǎng)期作用時(shí)抑菌效果更好。整體來看，OTC濃度越大，其對(duì)ZS1的生長(zhǎng)抑制作用越明顯[21]。

由圖1(c)和圖1(d)可以看出，ZS1對(duì)EM的耐受性比對(duì)OTC的耐受性好，EM在高濃度下的抑菌率最大為27.18%。具體來看，隨著EM濃度的增加，其對(duì)ZS1的生長(zhǎng)抑制率均明顯上升，但低濃度條件下，抑制率變化幅度較小。當(dāng)EM質(zhì)量濃度低于5 μg/L時(shí)，ZS1增殖能力不會(huì)受到明顯抑制作用。研究表明，隨著時(shí)間延長(zhǎng)EM的藥效會(huì)有一定程度的降低，在自然條件下EM的45 d降解率達(dá)到36.47%[22]。EM系列濃度作用48 h對(duì)ZS1的抑制率相對(duì)于作用24 h的數(shù)據(jù)同比降低，與ZS1對(duì)EM環(huán)境產(chǎn)生一定的適應(yīng)性有關(guān)，且EM自身的緩慢降解也會(huì)影響藥性[23]。

由圖1(e)和圖1(f)可以看出，SDZ對(duì)ZS1的生長(zhǎng)抑制率隨著濃度增加而增大，且由于ZS1對(duì)SDZ敏感性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，故培養(yǎng)48 h對(duì)ZS1的抑制率比培養(yǎng)24 h下降。單獨(dú)來看，高濃度條件下，SDZ對(duì)ZS1的最大抑制率達(dá)到16.47%。抑制效率隨濃度升高有明顯上升趨勢(shì)，同比對(duì)ZS1的生長(zhǎng)抑制作用較低。張從良等[24]研究發(fā)現(xiàn)，隨著好氧降解進(jìn)程的深入，經(jīng)藥物處理后細(xì)菌菌落總數(shù)增加較快，驗(yàn)證了SDZ對(duì)未滅菌湖水和豬場(chǎng)廢水中細(xì)菌菌落總數(shù)增長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。

圖1 3種抗生素對(duì)ZS1的抑菌效果培養(yǎng)時(shí)間，h：■—24； ■—48

綜上所述，不同種類的抗生素對(duì)ZS1的抑制效果不同，但整體來看，均是抗生素濃度越高，其對(duì)ZS1的生長(zhǎng)抑制效果越明顯。

2.2 不同濃度抗生素的CAT酶活性

CAT是一類主要起催化底物氧化還原的酶，CAT能有效地清除各種活性氧基團(tuán)，從而防止細(xì)胞膜系統(tǒng)的損壞[25]。通過紫外比色法對(duì)ZS1的CAT酶活性變化進(jìn)行探討，不同濃度的3種抗生素影響下的CAT酶活性如圖2所示。

由圖2可以看出，在分別加入3種抗生素后，CAT酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明在短時(shí)間接觸抗生素刺激下，細(xì)胞體內(nèi)遭受氧化應(yīng)激時(shí)，可以通過CAT酶活性的增加來減少細(xì)胞的氧化損傷[26]。這與Kuznaik和Sklodowska[27]分析番茄感染灰霉病后導(dǎo)致SOD、CAT酶活性增加的結(jié)論一致，表明最初的感染誘導(dǎo)了它們的活性，從而激活了植物抗氧化的防御。當(dāng)CAT酶活性顯著低于對(duì)照組時(shí)，細(xì)胞內(nèi)CAT酶的消耗與其產(chǎn)量之間不平衡，即活性氧積累過量，從而對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷。

從低濃度抗生素條件分析，如圖2(b)、圖2(d)和圖2(f)所示，與未受抗生素污染時(shí)的酶活性相比，添加OTC后CAT活性相對(duì)較高，其原因是抗生素的加入會(huì)給微生物帶來較大的氧化壓力，使微生物的呼吸作用增強(qiáng)，產(chǎn)生大量的H2O2，從而通過增加微生物中CAT酶活性來解除H2O2的毒害作用。當(dāng)CAT酶活性均高于對(duì)照組時(shí)，通過CAT酶產(chǎn)量的增加來減輕活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用?？股氐姆N類以及污染時(shí)間也會(huì)對(duì)CAT酶活性產(chǎn)生一定的影響。

圖2 3種抗生素影響下的CAT酶活性培養(yǎng)時(shí)間，h：■—24； ■—48

2.3 不同濃度抗生素的POD酶活性

POD是一種活性較高的氧化還原保護(hù)酶[28]。通過愈創(chuàng)木酚法對(duì)抗生素存在條件下ZS1的POD酶活性進(jìn)行探討，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出：添加OTC分別培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)，POD酶活性均隨OTC濃度的增大而下降，高濃度OTC對(duì)ZS1的抗氧化酶有較強(qiáng)的破壞性；隨著OTC濃度的增加，細(xì)胞受脅迫程度加深，酶活性整體呈下降趨勢(shì)。在OTC質(zhì)量濃度為0.05～1.00 mg/L的范圍內(nèi)，48 h條件下酶活性較大，表明該濃度范圍內(nèi)的OTC對(duì)ZS1具有一定的氧化作用，但不足以影響微生物產(chǎn)生更多的POD來清除體內(nèi)的過氧化物。然而，當(dāng)OTC質(zhì)量濃度大于1 mg/L后，OTC作用時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致ZS1細(xì)胞的破壞，酶活性整體呈下降趨勢(shì)。添加EM培養(yǎng)48 h條件下，當(dāng)EM質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)，POD酶的活性達(dá)到最高值。POD活性達(dá)到峰值時(shí)的濃度受抗生素種類所影響，POD對(duì)不同抗生素的耐受性不同。

圖3 3種抗生素影響下的POD酶活性培養(yǎng)時(shí)間，h：■—24； ■—48

2.4 不同濃度抗生素的SOD酶活性

SOD能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[29]。采用NBT法對(duì)抗生素存在條件下ZS1的SOD酶活性進(jìn)行探討，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，與培養(yǎng)初期(時(shí)間0 h)相比，添加高濃度OTC后，體系的SOD酶活性顯著降低，表明抗生素的加入會(huì)產(chǎn)生較多的超氧化物，其氧化作用抑制微生物產(chǎn)生更多的SOD。低濃度OTC條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，48 h時(shí)SOD酶活性有一定的上升，表明添加OTC后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，ZS1對(duì)OTC產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性。

圖4 3種抗生素影響下的SOD酶活性培養(yǎng)時(shí)間，h：■—24； ■—48

高濃度EM條件下，SOD酶活性先有微弱增長(zhǎng)趨勢(shì)，隨后活性下降。當(dāng)酶活性低于對(duì)照組時(shí)，由于活性氧積累過量而對(duì)細(xì)胞造成損傷。在添加低濃度EM條件下，培養(yǎng)48 h后的SOD酶活性變化幅度較大，其原因是一定濃度下EM引起活性氧的積累，造成細(xì)菌過氧化損傷，而SOD酶通過消除活性氧來保護(hù)細(xì)胞，表明抗氧化酶參與了細(xì)胞內(nèi)的解毒機(jī)制[30]。添加SDZ條件下，SOD酶活性變化幅度較小，說明濃度梯度不會(huì)影響SDZ對(duì)SOD酶合成的正常作用，不會(huì)明顯降低細(xì)菌的抗氧化、抗衰亡能力。

3 結(jié) 論

(1)抗生素濃度增加對(duì)ZS1生長(zhǎng)的抑制作用明顯增強(qiáng)，呈顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系。其中：培養(yǎng)24 h時(shí)OTC對(duì)ZS1的抑制效果弱于培養(yǎng)48 h時(shí)，可能是由于接觸時(shí)間太短，OTC還未充分發(fā)揮作用；低濃度條件下培養(yǎng)48 h時(shí)EM對(duì)ZS1的抑制率低于培養(yǎng)24 h的抑制率，與EM自身藥效隨時(shí)間降低會(huì)有一定關(guān)系；ZS1對(duì)SDZ的敏感性隨接觸時(shí)間的增加而降低。

(2)在不同抗生素污染條件下，CAT酶活性均有先上升后下降的趨勢(shì)，細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激時(shí)，均可以通過CAT酶活性的增加來減少細(xì)胞的氧化損傷。

(3)在抗生素污染條件下，隨著抗生物濃度增加，細(xì)胞受影響程度加深，POD酶活性整體呈下降趨勢(shì)；當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度低于30 μg/L時(shí)，其對(duì)POD酶活性影響不大，說明在該濃度范圍環(huán)境中雖產(chǎn)生了一定的氧化作用，但不足以影響微生物產(chǎn)生更多的POD來清除體內(nèi)的過氧化物。

(4)在抗生素污染條件下，SOD活性變化幅度較大，主要原因是活性氧積累造成細(xì)菌過氧化損傷，細(xì)菌通過SOD酶消除活性氧進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞；當(dāng)抗生素濃度低于30 μg/L時(shí)，不會(huì)影響SOD酶合成的正常機(jī)制，不會(huì)降低細(xì)菌的抗氧化、抗衰亡能力。