劉玉娟，郭思璇，劉珈宸，萬佳，吳春玲

（1.南昌市第一醫(yī)院，南昌 330006；2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南昌 330031；3.景德鎮(zhèn)市婦幼保健院婦產(chǎn)科，景德鎮(zhèn) 333099）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs簡稱：內(nèi)異癥）是具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮腔被覆內(nèi)膜及子宮肌層以外的部位[1]。EMs是育齡期婦女常見病、多發(fā)病，在人群中的發(fā)病率10%～15%，近年呈上升趨勢(shì)，被稱為“現(xiàn)代病”；該病雖為良性疾病，卻有侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等惡性表現(xiàn)，常引起痛經(jīng)、不孕、慢性盆腔疼痛等，嚴(yán)重危害廣大女性的健康和生活質(zhì)量，甚至被稱為“良性癌”[2]。目前子宮內(nèi)膜異位癥的金標(biāo)準(zhǔn)治療方案是手術(shù)切除和激素抑制卵巢功能，然而由于其有不同的副作用，且復(fù)發(fā)率高，因此，尋找致病的關(guān)鍵基因及可能影響EMs發(fā)生、發(fā)展的潛在的機(jī)制顯得尤為重要。

EMs的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚。目前仍以“經(jīng)血逆流種植”學(xué)說為主導(dǎo)，經(jīng)血逆流發(fā)生在76%～90%的人群，但只有10%的人發(fā)生EMs。因此，有學(xué)者提出了“在位內(nèi)膜決定論”[2]，即不同人（EMs和非EMs患者）經(jīng)血逆流的自內(nèi)膜碎片能否在異地“黏附—侵襲—血管生成”，在位內(nèi)膜是關(guān)鍵。鑒于異位癥的在位內(nèi)膜的重要地位，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，從開放的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO（Gene Expression Omnibus）中獲取子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜和正常人群的子宮內(nèi)膜的全基因組表達(dá)芯片，通過挖掘參與內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵樞紐基因和信號(hào)通路，為尋找子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制提供新思路，并為臨床診療提供新的標(biāo)志物和靶點(diǎn)。

1 材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲得 在GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nil.nih.gov/geo/）中，通過搜索關(guān)鍵詞“endometriosis”，獲得EMs的數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）來源于人類組織（Homo sapiens）；（2）樣本包含EMs的在位內(nèi)膜及正常人群的子宮內(nèi)膜芯片；（3）數(shù)據(jù)集的所有樣品來源于Affymetrix人類基因組U133陣列芯片；（4）來自全基因組RNA表達(dá)芯片。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）排除子宮腺肌??；（2）來源于細(xì)胞系的標(biāo)本；（3）基于非編碼RNA的研究。

1.2 差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes，DEGs)的鑒定 從GEO數(shù)據(jù)庫篩選出的符合標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)集后，對(duì)數(shù)據(jù)集中病人信息進(jìn)行逐一核對(duì)，并對(duì)病例組和正常對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)注。使用GEO自帶的差異分析工具GEO 2R，分析每個(gè)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因。采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05作為差異基因的入選標(biāo)準(zhǔn)，將3組數(shù)據(jù)集獲得的差異基因進(jìn)行比較后，剔除表達(dá)趨勢(shì)不同的差異基因，得到共同的差異基因。選取表達(dá)趨勢(shì)相同的差異基因作為本文后續(xù)進(jìn)行分析的差異基因。利用R軟件中heatmap包繪制了DEGs的熱圖。

1.3 蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) (protein-protein Interaction network，PPI)的構(gòu)建與模塊分析 利用STRING(Search Tool for the Retrieval of Interaction Genes/Proteins)數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)截值：置信度＞0.4，構(gòu)建差異基因編碼的蛋白間相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，以獲得深入理解和預(yù)測(cè)已鑒定的基因的細(xì)胞功能和生物行為。此外，利用Cytoscape軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了可視化[3]。

1.4 樞紐基因和關(guān)鍵模塊的選擇 使用CentiScaPe 2.1計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)的各節(jié)點(diǎn)的點(diǎn)度中心性，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的點(diǎn)度中心性的大小，確定了樞紐基因。節(jié)點(diǎn)的程度是節(jié)點(diǎn)上發(fā)生的平均（交互）數(shù)[4]。利用Cytoscape(version 3.6.1)中的分子復(fù)合檢測(cè)（Molecular Complex Detection，MCODE)插件對(duì)Cytoscape中PPI網(wǎng)絡(luò)的模塊進(jìn)行篩選，取截?cái)喽?2，節(jié)點(diǎn)得分截?cái)嘀?0.2，k-core=2，深度=100的標(biāo)準(zhǔn)下，得到一個(gè)MCODE_Score=10的PPI網(wǎng)絡(luò)最核心模塊。

1.5 將核心模塊基因進(jìn)行KEGG通路分析KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）是一個(gè)可以系統(tǒng)性地分析基因功能的數(shù)據(jù)庫，可以揭示差異表達(dá)基因的主要的代謝和信號(hào)通路。使用基于網(wǎng)絡(luò)的基因分析工具WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit（http://www.webgestalt.org），對(duì)核心模塊中的DEGs進(jìn)行KEGG富集分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)篩選 GEO數(shù)據(jù)集中共3個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集符合標(biāo)準(zhǔn)。3個(gè)數(shù)據(jù)集分別是GSE25628、GSE 7305和GSE6364。子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜定義為病例組，非子宮內(nèi)膜異位癥的在位內(nèi)膜定義為正常對(duì)照組。GSE25628包含9個(gè)病例和6個(gè)正常樣本，GSE7305包含10個(gè)病例和10個(gè)正常樣本，GSE6364包含21個(gè)病例和16個(gè)正常樣本。一共40個(gè)病例和32個(gè)正常樣本，見表1。

表1 所納入的數(shù)據(jù)集及樣本信息

2.2 差異表達(dá)基因的鑒別 通過對(duì)GSE6364數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，得到3901個(gè)差異表達(dá)基因，其中有1194個(gè)基因下調(diào)，2707個(gè)基因上調(diào)（圖1-A）；GSE7305數(shù)據(jù)集有12659個(gè)差異表達(dá)基因，其中有7156個(gè)基因下調(diào)，5503個(gè)基因上調(diào)（圖1-B）；GSE25628數(shù)據(jù)有6541個(gè)差異表達(dá)基因，其中有2693個(gè)基因下調(diào)，3848個(gè)基因上調(diào)（圖1-C）。將三個(gè)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因進(jìn)行求交集，共得到1010個(gè)共有的差異表達(dá)基因（圖1-D），剔除表達(dá)趨勢(shì)不同的差異基因，最后有279個(gè)穩(wěn)定的差異表達(dá)基因，其中171個(gè)基因穩(wěn)定上調(diào)，108個(gè)基因穩(wěn)定下調(diào)，見表2。

圖1 GEO中三個(gè)數(shù)據(jù)集的差異基因鑒別及共同的差異基因

表2 上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊分析 利用STRING分析DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖2-A。利用Cytoscape的MCODE插件獲得了最顯著的一個(gè)模塊，包括10個(gè)樞紐基因，其中SART1、PQBP1和CTNNBL1表達(dá)上調(diào)，SNRPE、HNRNPA1、WDR33、PAPOLA、PCF11、DDX5和PABPN1表達(dá)下調(diào)(圖2-B)。

圖2 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心模塊

2.4 對(duì)樞紐基因進(jìn)行KEGG通路富集分析KEGG通路分析顯示，樞紐基因主要富集于剪接體通路，mRNA監(jiān)測(cè)途徑，癌癥相關(guān)通路中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)和蛋白聚糖通路，見圖3。

圖3 樞紐基因KEGG通路富集分析

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制不清，雖然是一種良性病，但在生物學(xué)上又有著類似腫瘤的特性—侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，是一種“良性癌”[5]。大量證據(jù)表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜具有別于正常子宮內(nèi)膜的特性，在“黏附—侵襲—血管生成”方面均較正常子宮內(nèi)膜強(qiáng)的生物活性，因此，又有了“在位內(nèi)膜決定論”[2，6-7]。近年來隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，對(duì)揭示疾病的分子機(jī)制具有重要意義。其中基因芯片技術(shù)，又名微陣列技術(shù)（DNA array），是一項(xiàng)隨著“人類基因組計(jì)劃”實(shí)施而逐漸發(fā)展起來的新型技術(shù)，目前已被用于高效、大規(guī)模的生物信息的采集，廣泛地收集疾病的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，廣泛應(yīng)用于疾病的基因診斷與治療、藥物篩選和藥物開發(fā)等。

本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)，從開放的公共數(shù)據(jù)庫GEO中，篩查并比較了異位癥患者的在位內(nèi)膜和非內(nèi)異癥在位內(nèi)膜基因表達(dá)譜的差異，篩查出279個(gè)穩(wěn)定的差異表達(dá)基因，包括171個(gè)穩(wěn)定上調(diào)基因，108個(gè)穩(wěn)定下調(diào)基因。這提示EMs的在位內(nèi)膜與非EMs患者自身就攜帶某種致病基因，使得其更容易發(fā)生子宮內(nèi)膜異位癥，從而在源頭上揭示內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜的“種子”效應(yīng)。為了進(jìn)一步明確差異表達(dá)基因功能，對(duì)279個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊分析，得到功能最強(qiáng)的模塊，其包含10個(gè)樞紐基因，其中SART1、PQBP1和CTNNBL1表達(dá)上調(diào)，SNRPE、HNRNPA1、WDR33、PAPOLA、PCF11、DDX5和PABPN1表 達(dá)下調(diào)。這些樞紐基因可能為EMs的關(guān)鍵致病基因，可為疾病的診斷及靶基因治療提供了新的靶點(diǎn)。

對(duì)樞紐基因進(jìn)行KEGG通路富集分析提示，剪接體通路是富集最強(qiáng)的通路。剪接體(spliceosome)是指進(jìn)行RNA剪接時(shí)形成的多組分復(fù)合物，由5個(gè)小的核核糖核蛋白粒子(snRNPs)和超過100多個(gè)蛋白質(zhì)組成的大分子結(jié)構(gòu)[8]，可以識(shí)別mRNA前體的5′剪接位點(diǎn)、3′剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)。mRNAs前體的剪接過程包括內(nèi)含子的切除和外顯子結(jié)合在一起，形成成熟的mRNA轉(zhuǎn)錄本，最后被翻譯為蛋白質(zhì)，這一過程是通過剪接體實(shí)現(xiàn)的。然而，和大多數(shù)生物過程一樣，選擇性剪接過程一旦出現(xiàn)異常，將導(dǎo)致疾病的發(fā)生，目前研究最多的是在癌癥[9-10]和自身免疫性疾病中[11]。剪接的失調(diào)參與腫瘤生物發(fā)生和發(fā)展，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、侵襲、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成和化學(xué)/放射治療耐藥性[12-13]。例如，調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因Bcl-x有兩種剪接變異體，兩者在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面功能相反。短亞型Bcl-xS促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而長亞型Bcl-xL抑制細(xì)胞凋亡。因此，Bcl-xL的過度表達(dá)與癌轉(zhuǎn)移及化療藥物的耐藥性風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[14]。顯然，剪接體影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

然而，關(guān)于剪接體與子宮內(nèi)膜異位癥的報(bào)道并不多。有研究表明，survivin有兩種剪接變異體(survivin-2B和survivin-EX3)，剪接變異體的表達(dá)模式在惡性腫瘤中survivin-EX3占主導(dǎo)，在良性腫瘤中survivin-2B占主導(dǎo)。在內(nèi)異癥患者中檢測(cè)到survivin及變異體的改變，且在腹膜子宮內(nèi)膜異位病變的survivin-EX3/surviving比例明顯高于在位子宮內(nèi)膜，反映了子宮內(nèi)膜異位癥在生物學(xué)上有類似腫瘤的特性[15]。類似報(bào)道還有，雌激素受體β及其剪接變體[16]以及CD44變異體[17]的增加，均可影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。

此外，對(duì)樞紐基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，還提示mRNA監(jiān)測(cè)途徑和癌癥相關(guān)通路中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)和蛋白聚糖通路與子宮內(nèi)膜異位癥密切相關(guān)，然而這些通路同時(shí)也是癌癥的相關(guān)通路。由此可見，子宮內(nèi)膜異位癥與腫瘤的發(fā)生有著共同的信號(hào)通路，這就解釋了，為什么EMs在“黏附—侵襲—血管生成”等方面均具有類腫瘤的惡性行為。

綜上，子宮內(nèi)膜異位癥是一個(gè)多病因的疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。EMs的在位內(nèi)膜在基因表達(dá)上有別于正常子宮內(nèi)膜，是誘導(dǎo)EMs發(fā)生的根源，而其他的激素、免疫等因素只是影響內(nèi)膜能否在異地生存的附加條件。本研究通過生物信息學(xué)分析鑒定子宮內(nèi)膜異位癥關(guān)鍵樞紐基因和信號(hào)通路，提高了我們對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的潛在分子事件和發(fā)病機(jī)制的理解，這對(duì)EMs的預(yù)測(cè)及基因靶向治療具有重要意義。