秦潔 郭宇 楊華 楊晨濤

心力衰竭（heart failure，HF）在老年人群中越來越常見，并且HF患者常伴有心房顫動（atrial fibrillation，AF）。AF是一種常見的持續(xù)性心律失常，與顯著增加的住院率、發(fā)病率和死亡率相關[1]，目前已有多種治療方法可以提高患者的生存率，但其治療機制并不明確，因此分析HF合并AF的發(fā)病機制具有重要意義。微小 RNA（microRNA，miRNA，miR）是一種短小的、非編碼的單鏈RNA，其可在轉(zhuǎn)錄后的水平上調(diào)控基因表達[2]。有體外研究顯示，miR-125b-5p具有抑制HF心肌細胞凋亡的作用[3]，但其在體內(nèi)對HF合并AF心肌細胞的影響仍不清楚。程序性死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是細胞凋亡的關鍵誘導因子，有研究發(fā)現(xiàn)PDCD4被miRNA抑制后，HF心肌細胞凋亡率降低[4]。p53也是調(diào)節(jié)細胞存活、凋亡的多功能蛋白，有研究顯示抑制p53表達能保護HF大鼠的心功能[5]。本研究通過建立HF大鼠模型并誘導發(fā)生AF，旨在探討miR-125b-5p通過靶向p53及PDCD4的表達來調(diào)控HF合并AF心肌細胞凋亡的機制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級成年雄性SD大鼠（南京金陵醫(yī)院）55 只，體重 230～250 g。心肌細胞 H9C2（CRL-1446，美國ATCC公司）。試劑：miR-125b-5p類似物（miR-125b-5p mimic）和陰性對照（miR-125b-5p NC）（上海吉瑪制藥技術有限公司，1 mg/ml，注射制劑）。HE染色、TUNEL法和ELISA試劑盒（美國Roche公司）。RNAspin Mini和miRNeasy Mini試劑盒（美國GE Healthcare公司）。BestarTMqPCR試劑盒（德國DBI Bioscience公司）。TaqMan miRNA試劑盒（美國Thermo Fisher公司）。抗-PDCD4（ab79405）、抗-p53（ab32389）和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（ab6721）（美國Abcam公司）?；瘜W發(fā)光試劑盒（美國Thermo Fisher公司）。DMEM培養(yǎng)基和抗體（美國Gibco公司）。pGL4熒光素酶載體（美國Promega公司）。pcDNA3.1 PDCD4、p53質(zhì)粒、空載體（vector）、快速定點誘變試劑盒和Renilla熒光素酶質(zhì)粒（中國Beyotime公司）。硝酸纖維素膜（默克公司）。Lipofectamine?2000（美國 Invitrogen公司）。儀器：HP SONOS 5500型的超聲心動圖儀（美國飛利浦公司）。心電圖儀（澳大利亞PowerLab公司）。聚偏二氟乙烯膜（美國EMD Millipore公司）。顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）。96孔、24孔組織培養(yǎng)板（美國康寧公司）。熒光素酶報告試劑盒和檢測儀1000 System（美國Promega公司）。

1.2 大鼠建模、分組和干預方法 先通過射頻消融誘導建立HF大鼠模型[6]。將40只大鼠使用4%水合氯醛麻醉，固定體位后氣管插管（潮氣量 20 ml/kg，呼吸頻率50次/min）并連接心電圖。隨后開胸，撕開心包腔暴露心臟，使用導管在左心室的游離壁上進行射頻消融1次（12 W，12 s）。然后，將心臟迅速放回胸腔內(nèi)，簡單縫合胸腔。待大鼠恢復意識后，以 12 h黑暗/12 h光照周期在籠子中飼養(yǎng)8周。8周后，采用超聲心動圖檢查心功能，左心室射血分數(shù)（LVEF）＜45%視為HF建模成功。

再通過程序性電刺激誘導建立AF模型[7]。大鼠同上法麻醉、口氣管插管，將一根 4-French四極導管穿過食管并放置在心房捕獲閾值最低的部位，使用自動刺激器軟件以35 s脈沖誘導房性心律失常的發(fā)生。每個脈沖串的周期長度為 20 ms，脈沖寬度為 5 ms。如果突發(fā)起搏后持續(xù)出現(xiàn)快速、不規(guī)則的心房節(jié)律至少2 s，視為AF建模成功。最終32只大鼠建模成功。選擇其中30只采用隨機數(shù)字表法分為miR-125b-5p組和模型組，每組15只。另取15只正常大鼠作為對照組，僅打開胸腔暴露心臟后縫合。miR-125b-5p組大鼠尾靜脈注射miR-125b-5p mimic以提高miR-125b-5p 水平[8]，300 μg/次，1 次/周，連續(xù) 4 周。

1.3 觀察指標

1.3.1 心功能和AF指標檢測 12周后，采用超聲心動圖檢查心功能，包括LVEF和左心室短軸縮短率（LVFS）。采用心電圖檢查AF誘導率和誘導時間。

1.3.2 大鼠心肌組織病理檢查 完成上述檢測后脫頸處死大鼠后取心肌組織，用10%甲醛溶液固定48 h，流水沖洗。95%乙醇脫水，然后將心肌組織浸入石蠟中制成蠟塊，將其切成 4～7 μm厚度的切片，置于載玻片上，放置在 65℃恒溫烘箱中 30 min，然后在二甲苯Ⅰ中 15 min、二甲苯Ⅱ中 15 min脫蠟。脫蠟切片用95%乙醇浸泡5 min，自來水沖洗10 min。然后將切片行HE染色后在光學顯微鏡下觀察。

1.3.3 細胞凋亡檢測 采用TUNEL法。石蠟包埋的心肌組織5 μm切片用二甲苯脫蠟2次，10 min/次，然后經(jīng)過梯度乙醇脫水（乙醇濃度：100%、95%、90%、80%和70%）。切片在37℃潮濕暗箱中用50 μl的 TUNEL反應溶液處理 60 min后，加入50 μl鏈霉親和素-HRP工作液孵育30 min。采用 DAPI對細胞核進行熒光染色，然后進行常規(guī)脫水、脫色和固定。檢查細胞凋亡情況并使用光學顯微鏡捕獲圖像，計算TUNEL陽性細胞數(shù)的比例即為細胞凋亡指數(shù)（%）。

1.3.4 miR-125b-5p、PDCD4和p53 mRNA相對表達水平檢測 采用RT-qPCR法。使用miRNeasy Mini試劑盒提取總miRNA，并通過TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒形成cDNA。然后使用TaqMan miRNA分析試劑盒測定miRNA表達水平。通過比較循環(huán)閾值并以U6作為內(nèi)參，計算miR-125b-5p相對表達水平。使用RNeasy Mini試劑盒提取心肌組織中的總RNA。BestarTMqPCR試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37℃15 min，98℃ 5 min。然后使用BestarTMqPCR預混液進行qPCR實驗，條件如下：95℃2 min，94℃20 s，58℃20 s，72℃20 s，40個循環(huán)，最后72℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參，計算PDCD4和p53 mRNA相對表達水平。

1.3.5 PDCD4和p53蛋白相對表達水平檢測 采用Westernblot法。心肌組織裂解后通過離心（4℃，12 000 r/min，5 min）收集總蛋白。通過8%SDS-PAGE分離每個樣品中等量（50 μg）蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h封閉非特異性抗原。隨后，將膜與抗-PDCD4和抗-p53在4℃下孵育過夜，然后將膜與相應的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。使用化學發(fā)光試劑顯示，以GAPDH作為內(nèi)參，采用Quantum One軟件分析灰度計算PDCD4和p53蛋白相對表達水平。

1.3.6 雙熒光素酶報告實驗 miR-125b-5p與PDCD4和p53的堿基結(jié)合位點通過工具網(wǎng)站得到（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）。將野生型（wt-）的PDCD4或者p53 mRNA的3'-非翻譯區(qū)域的序列擴增到pGL4熒光素酶載體的下游位點，使用快速定點誘導試劑盒生成突變型（mut-）PDCD4或者p53。將H9C2細胞以3×104個/孔的密度接種在24孔板中，24 h后，使用Lipofectamine?2000將 1 μg的 wt-PDCD4/p53或者mut-PDCD4/p53熒光素酶質(zhì)粒、50 nM的miR-125b-5p mimic或者 miR-125b-5p NC、150 ng的 Renilla熒光素酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入細胞。然后將細胞在37℃下孵育36 h。根據(jù)說明書，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。所有數(shù)據(jù)均以Renilla熒光素酶活性進行標準化。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料組間比較采用 χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠LVEF、LVFS的比較 3組大鼠LVEF、LVFS的差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。miR-125b-5p組LVEF和LVFS均高于模型組，模型組LVEF和LVFS均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠LVEF、LVFS的比較（%）

2.2 3組大鼠AF誘導率和誘導時間的比較 3組大鼠AF誘導率和誘導時間比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。miR-125b-5p組的AF誘導率和誘導時間均低于模型組，模型組均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見表 2。

表2 3組大鼠AF誘導率和誘導時間的比較

2.3 3組大鼠心肌細胞病理檢查結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，miR-125b-5p組細胞排列異常和損傷情況均較輕。模型組心肌細胞形狀發(fā)生改變，排列紊亂，細胞間隙變大，染色變淺，并出現(xiàn)纖維化狀態(tài)。對照組心肌細胞排列整齊，細胞間隙均勻、清晰。見圖1（插頁）。

圖1 miR-125b-5p對HF合并AF大鼠心肌損傷的影響（a：對照組；b：模型組；c：miR-125b-5p組；HE染色，×200）

2.4 3組大鼠心肌細胞凋亡情況的比較 正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈綠色。miR-125b-5p組可見部分細胞核固縮、呈綠色熒光，但綠色熒光細胞數(shù)目少于模型組，凋亡情況較模型組輕；模型組細胞密度較小，細胞核呈綠色熒光發(fā)亮、固縮；對照組心肌細胞密度較大且均勻分布，細胞核表現(xiàn)為均勻亮藍色熒光；見圖2（插頁）。3組大鼠的心肌細胞凋亡指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。miR-125b-5p組的凋亡指數(shù)低于模型組，模型組高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見表 3。

圖2 miR-125b-5p對HF合并AF大鼠心肌細胞凋亡的影響（a：對照組；b：模型組；c：miR-125b-5p組；TUNEL染色，×400）

表3 3組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的比較（%）

2.5 3組大鼠miR-125b-5p、PDCD4和p53 mRNA相對表達水平的比較 3組大鼠心肌細胞中miR-125b-5p、PDCD4和p53 mRNA水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。miR-125b-5p組的miR-125b-5p高于模型組和對照組，PDCD4和p53 mRNA水平低于模型組（均P＜0.05），模型組的miR-125b-5p低于對照組，而PDCD4和p53 mRNA水平高于對照組（均P＜0.05），見表 4。

表4 3組大鼠miR-125b-5p、PDCD4和p53 mRNA相對表達水平的比較

2.6 3組大鼠PDCD4和p53蛋白相對表達水平的比較 3組大鼠心肌細胞中PDCD4和p53蛋白相對表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。miR-125b-5p組的PDCD4和p53蛋白相對表達水平均低于模型組，模型組均高于對照組（均P＜0.05），見圖3和表5。

圖3 Western blot檢測miR-125b-5p對HF合并AF大鼠PDCD4和p53蛋白相對表達水平的電泳圖

表5 3組大鼠PDCD4和p53蛋白相對表達水平的比較

2.7 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-125b-5p與PDCD4的靶向關系 miR-125b-5p與PDCD4的靶向結(jié)合位點見圖4。當轉(zhuǎn)染共同轉(zhuǎn)染wt-PDCD4和miR-125b-5p mimic后，細胞中的相對熒光素酶活性降低（P＜0.05），證明miR-125b-5p與PDCD4的靶向結(jié)合。見表6。

圖4 微小RNA（miR）-125b-5p與程序性死亡因子4 mRNA的3'端的非翻譯區(qū)域的結(jié)合位點

表6 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-125b-5p與PDCD4的靶向關系（相對熒光素酶活性）

2.8 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-125b-5p與p53的靶向關系 miR-125b-5p與p53的靶向結(jié)合位點見圖5。當轉(zhuǎn)染共同轉(zhuǎn)染wt-p53和miR-125b-5p mimic后，細胞中的相對熒光素酶活性降低（P＜0.05），證明miR-125b-5p與p53的靶向結(jié)合。見表7。

圖5 微小 RNA（miR）-125b-5p與p53 mRNA的3'端的非翻譯區(qū)域的結(jié)合位點

表7 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-125b-5p與p53的靶向關系（相對熒光素酶活性）

3 討論

AF是源自異常心房基質(zhì)的復雜過程，具有多種誘發(fā)因素，如糖尿病、缺血性心臟病、衰老、高血壓、肥胖、阻塞性睡眠呼吸暫停、遺傳因素等，其中HF是最常見的誘發(fā)因素，HF合并AF的生理過程涉及心肌的結(jié)構和離子變化[9]。分析HF合并AF的機制具有重要的意義。

miRNA是一種長度約為22個核苷酸長度的、高度保守的單鏈RNA，其可與mRNA的3'端的非翻譯區(qū)域基于堿基互補配對的原理結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄后的水平上導致mRNA的降解或者翻譯抑制[10]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在HF和AF的發(fā)生和進展中發(fā)揮關鍵作用，如miR-665過表達通過抑制PTEN的表達加重了主動脈狹窄誘導的心臟功能障礙[11]。miR-324-3p通過靶向AF中的 TGF-β1調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖[12]。賈成林等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-499參與AF的發(fā)生。也有研究顯示miR-21與心房功能障礙的超聲心動圖參數(shù)相關，可作為預測AF的標志物[14]。miR-125是一種新發(fā)現(xiàn)的具有心臟保護作用的miRNA，研究顯示miR-125b-5p的降低會加劇急性心肌梗死引起的心肌損傷，而過表達miR-125b-5p可以抑制心肌損傷[15]。為分析miR-125b-5p在HF合并AF中的作用，本研究通過射頻消融誘導HF，并通過程序性電刺激誘導AF，將LVEF＜45%合并AF的大鼠作為研究對象，通過尾靜脈注射miR-125b-5p mimic來提高心肌細胞中miR-125b-5p水平，結(jié)果顯示HF合并AF大鼠的心肌組織中miR-125b-5p水平明顯降低，而提高miR-125b-5p水平顯著緩解新心肌組織的損傷和心肌細胞的凋亡，并提高了心臟的射血功能，降低AF誘導率和誘導時間。心肌細胞的凋亡是導致HF和誘發(fā)AF的重要機制，有研究表明miR-125b-5p通過靶向Ras關聯(lián)域家族 1蛋白的表達抑制了梗死誘導的心肌細胞凋亡[16]。根據(jù)文獻報道和本研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HF合并AF的心肌組織中miR-125b-5p水平降低，并且提高miR-125b-5p的水平能夠抑制心肌細胞凋亡，并緩解HF和AF癥狀，提高心功能。

為進一步分析miR-125b-5p的心臟保護作用機制，筆者檢測了心肌組織中凋亡相關PDCD4和p53蛋白的表達。凋亡引起的心肌細胞丟失不但會直接影響心臟收縮功能參與HF，也會直接影響電信號的傳遞導致心律失常引起AF[17-18]。PDCD4和p53均是調(diào)節(jié)細胞凋亡的關鍵蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p可通過靶向抑制p53蛋白的表達抑制心肌細胞凋亡，從而緩解急性心肌梗死[19]。Luo等[20]究結(jié)果也顯示提高miR-125b-5p水平會通過靶向抑制PDCD4和p53蛋白表達水平抑制心肌細胞凋亡，并緩解缺氧/復氧引起的心臟損傷。本研究結(jié)果表明HF合并AF大鼠的心肌組織中的PDCD4和p53蛋白水平均明顯升高，而提高miR-125b-5p水平會抑制PDCD4和p53蛋白水平。此外，在心肌細胞中，也驗證了miR-125b-5p能夠靶向PDCD4和p53。結(jié)果文獻和本研究結(jié)果均提示在心肌細胞中，miR-125b-5p能夠靶向抑制PDCD4和p53蛋白水平來抑制心肌細胞的凋亡。

綜上所述，miR-125b-5p通過抑制PDCD4和p53蛋白抑制心肌細胞的凋亡，從而緩解HF和并AF。關于miR-125b-5p在HF合并AF中的作用仍需要臨床研究證實。