趙 鍇 晉秀娟 孫麗麗 閆榮岳 盧 娟 郭 峰 Md Ashraful Islam 史雨剛 孫黛珍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，030801，山西晉中）

衰老是作物生長發(fā)育的必然過程，受多種基因的協(xié)同調(diào)控[1]。葉片是作物進(jìn)行一系列化學(xué)反應(yīng)的重要器官，葉片衰老最明顯的標(biāo)志是顏色由綠變黃，特點(diǎn)是葉綠素的大量降解。葉片衰老是在葉片發(fā)育的后期，由植物內(nèi)部多基因控制的一系列有序的衰敗過程。小麥葉片衰老伴隨著葉綠素降解和籽粒灌漿2個(gè)過程，葉片早衰會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量的極大損失[2]。因此研究葉綠素降解過程中與脫植基反應(yīng)相關(guān)的基因可為選育高產(chǎn)小麥品種提供理論基礎(chǔ)。

高等植物體內(nèi)的葉綠素包括葉綠素 a（chlorophyll a，Chl a）和葉綠素b（chlorophyll b，Chl b），它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)高度相似，只是吡咯環(huán)II上的附加基團(tuán)存在差異，Chl a附加基團(tuán)是甲基（?CH3），Chl b是醛基（?CHO）。自從Hendry等[3]闡明葉綠素降解是一種生化過程之后，人們對葉綠素降解途徑的研究就沒有停下過腳步。研究[4-6]表明，葉綠素的降解早期發(fā)生在葉綠體中，Chl b能在葉綠素b還原酶（chlorophyll b reductase，CBR）的作用下還原生成Chl a。而葉綠素的降解是從Chl a開始的，首先Chl a去鎂離子去植基生成脫鎂葉綠酸a（pheophorbide a，Pheide a），然后Pheide a在脫鎂葉綠酸a氧化酶（pheophorbide a oxygenase，PAO）作用下打開卟啉環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色葉綠素代謝產(chǎn)物（red chlorophyll catabolite，RCC），經(jīng)紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶（red chlorophyll catabolite reduetase，RCCR）催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成初級熒光葉綠素代謝物（primer fluorescent chlcatabolite，pFCC），之后，將其從葉綠體中導(dǎo)出，經(jīng)過幾次修飾運(yùn)輸至液泡中，經(jīng)過酸性液泡非酶異構(gòu)催化轉(zhuǎn)化為它們各自的非熒光葉綠素代謝產(chǎn)物（non fluorescent chlorophyll catabolites，NCCs）。

Chl a在生成Pheide a的過程中存在2條不同的途徑[7-8]：一條途徑是Chl a在葉綠素酶（chlorophyllase，CLH）的作用下，先脫去植基形成脫植基葉綠素a（Chlide a）和葉綠醇，然后Chlide a由一個(gè)脫鎂螯合物（metal cheating substance，MCS）通過非酶促過程去除Mg2+形成Pheide a，并保持卟啉大環(huán)結(jié)構(gòu)；另一條途徑是Chl a先在MCS作用下去除Mg2+生成脫鎂葉綠素a（Phein a），再在脫鎂葉綠素水解酶（pheophytin pheophorbide hydrolase，PPH）的作用下脫去植基，生成Pheide a。在這2條途徑中，CLH和 PPH與葉綠素降解過程中的脫植基反應(yīng)密切相關(guān)。研究表明，CLH在西葫蘆和煙草[9]等作物葉綠素降解過程的脫植基反應(yīng)中起主要作用，而PPH在擬南芥[8]、水稻[10]和番茄[11]等作物葉綠素降解過程中的脫植基反應(yīng)中起主要作用。小麥葉片衰老過程中葉綠素降解究竟是哪條途徑，即哪個(gè)脫植基相關(guān)酶起主要作用，至今并無報(bào)道?；诖?，本試驗(yàn)以10個(gè)春性小麥品種為材料，對小麥花后葉片衰老過程中相對葉綠素含量（SPAD）、功能綠葉面積（green leaf area duration，GLAD）和葉綠素?zé)晒鈪?shù)[ETR、Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qP]的變化以及脫植基反應(yīng)相關(guān)基因（TaCLH和TaPPH）的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，初步了解TaCLH和TaPPH在不同春性小麥葉片脫植基降解過程中的作用，為解析小麥葉片葉綠素的降解機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的10個(gè)普通春性小麥（Triticum aestivumL.）品種由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種課題組提供。包括晉麥2148、寧春13號、內(nèi)麥19號、博愛7023、生選3號、川麥22、綿陽15號、新春8號、寧春4號、青春5號。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2020年10月8日將試驗(yàn)材料種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院申奉試驗(yàn)基地。試驗(yàn)地土壤20cm土層含有機(jī)質(zhì) 19.54g/kg、速效鉀 92.77mg/kg、有效磷4.45mg/kg、堿解氮 41.65mg/kg。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，行長2m，行距0.2m，每個(gè)品種種植2行，每行點(diǎn)播40粒。11月29日澆越冬水后，用地膜覆蓋，翌年2月份揭膜，其他田間管理同一般大田生產(chǎn)。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

2021年5月上旬開始統(tǒng)計(jì)開花期，各小麥品種每個(gè)重復(fù)選擇開花一致、長勢均勻的30株進(jìn)行掛牌標(biāo)記。

1.3.1 GLAD 通過目測將小麥GLAD分為10個(gè)等級（0～9）[12]，葉片全黃記為0，葉片全綠記為9，0～9間數(shù)值表示葉片由綠變黃的程度，于花后7d開始記錄掛牌小麥主莖旗葉的GLAD等級，每隔3d記錄1次。

1.3.2 SPAD 采用美能達(dá)公司生產(chǎn)的葉綠素測定儀（SPAD-502，Minolta，日本）于花后7d開始分別測定掛牌小麥主莖旗葉SPAD值，每隔3d測定1次，測定時(shí)避開葉脈，每片葉子測定葉片的上、中、下3個(gè)部位，取平均值。

1.3.3 衰老特征參數(shù) 利用測定的小麥旗葉衰老過程中SPAD和GLAD數(shù)據(jù)擬合Gompertz曲線，獲得小麥旗葉SPAD和GLAD的變化曲線。通過對Gompertz曲線求一階和二階導(dǎo)數(shù)得出小麥衰老過程中的特征參數(shù)，包括最大衰老速率（MRS）、達(dá)到最大衰老速率的時(shí)間（TMRS）、衰老起始時(shí)間（Ts）和衰老終止時(shí)間（T0）。

1.3.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 使用便攜式葉綠素?zé)晒鈨x（MINI-PAM-Ⅱ，Walz，德國）于花后7d開始對掛牌小麥主莖進(jìn)行測量，每隔3d測定1次。葉綠素?zé)晒鈪?shù)包括光合電子傳遞速率（ETR）、PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、PSII實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量[Y(Ⅱ)]和光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）。

1.3.5 基因表達(dá)分析 在田間測定之后，取相應(yīng)小麥旗葉立即放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。使用天根生化科技（北京）有限公司RNA提取試劑盒進(jìn)行小麥總RNA提取，使用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行小麥cDNA分離，使用熒光定量試劑盒進(jìn)行小麥基因表達(dá)的測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析與制圖，用SAS軟件進(jìn)行衰老特征參數(shù)的計(jì)算，用SPSS 23軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種春性小麥花后旗葉 SPAD及 GLAD值的動(dòng)態(tài)變化

從圖1a可以看出，隨著花后籽粒灌漿過程的進(jìn)行，參試的10個(gè)小麥材料旗葉SPAD值呈先平緩下降后快速下降的趨勢，快速下降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)在花后19～22d。花后各時(shí)期小麥品種川麥22旗葉SPAD值均明顯高于其他品種。從圖1b可以看出，隨著花后籽粒灌漿的進(jìn)行，參試的10個(gè)小麥材料旗葉GLAD值整體上在7～19d平緩下降，19d之后呈現(xiàn)快速下降趨勢。

圖1 不同品種春性小麥花后主莖旗葉SPAD和GLAD值的動(dòng)態(tài)變化Fig. 1 Dynamic changes of SPAD and GLAD values of flag leaves on main stem of different spring wheat varieties after anthesis

2.2 基于SPAD和GLAD值的不同品種春性小麥葉片衰老特征與聚類分析

從表1可以看出，參試品種的衰老特征參數(shù)存在差異?；赟PAD值，博愛7023、生選3號、川麥22和綿陽15號衰老起始時(shí)間晚，MRS高，具有較短的衰老持續(xù)時(shí)間，衰老快。內(nèi)麥19號、新春8號、寧春4號和青春5號衰老起始早，但MRS小，即衰老緩慢，衰老持續(xù)時(shí)間長，衰老終止晚?；贕LAD值的10個(gè)春性小麥品種的MRS和Ts沒有顯著差異，衰老緩慢，衰老持續(xù)時(shí)間長，導(dǎo)致衰老終止晚。

表1 不同品種春性小麥花后基于SPAD及GLAD值的衰老特征參數(shù)Table 1 Aging characteristic parameters based on SPAD and GLAD values in different spring wheats after anthesis

基于花后SPAD值的衰老特征參數(shù)對參試的10個(gè)小麥材料進(jìn)行系統(tǒng)聚類（圖2），參試的10個(gè)小麥材料可分為 3類，類群Ⅰ包括晉麥 2148、博愛7023、生選3號、綿陽15號和川麥22這5個(gè)品種，類群Ⅱ包括內(nèi)麥19號、新春8號、青春5號和寧春4號這4個(gè)品種，類群Ⅲ包括寧春13號。

圖2 不同品種春性小麥基于SPAD值的系統(tǒng)聚類圖Fig.2 The systematic clustering diagram of different spring wheat based on SPAD values

從表2可以看出，基于SPAD值，類群Ⅱ與類群Ⅰ、Ⅲ相比，雖然衰老起始早，但由于最大衰老速率較小，使得衰老終止較晚，其持綠期較長。類群Ⅰ與類群Ⅱ、Ⅲ相比，雖然衰老起始時(shí)間晚，但是衰老最大速率大，使得衰老終止早，持綠期較短。因此，我們把類群Ⅰ歸為非持綠性品種，類群Ⅱ歸為持綠性品種，類群Ⅲ為中間類型。

表2 3類小麥基于SPAD和GLAD值的衰老特征參數(shù)Table 2 Aging characteristic parameters based on SPAD and GLAD values in three groups of wheat

基于花后 GLAD值的衰老特征參數(shù)對參試的10個(gè)小麥材料進(jìn)行系統(tǒng)聚類（圖3），參試的10個(gè)小麥材料可分為3個(gè)類群，類群Ⅰ包括晉麥2148、寧春13號、內(nèi)麥19號和博愛7023這4個(gè)品種，類群Ⅱ包括生選3號和新春8號這2個(gè)品種，類群Ⅲ包括川麥22、綿陽15號、寧春4號和青春5號這4個(gè)品種。從表2可以看出，基于GLAD值，類群Ⅲ與類群Ⅰ、Ⅱ相比，雖然衰老起始早但由于最大衰老速率較小，使得衰老終止較晚，其持綠期較長。類群Ⅰ與類群Ⅱ和Ⅲ相比，雖然衰老起始時(shí)間晚但是衰老最大速率大，衰老終止早持綠期較短。因此，我們把類群Ⅰ歸為非持綠性品種，類群Ⅱ?yàn)橹虚g類型，類群Ⅲ歸為持綠性品種。

圖3 不同品種春性小麥基于GLAD值的系統(tǒng)聚類圖Fig.3 The systematic clustering diagram of different spring wheat based on GLAD values

2.3 不同品種春性小麥花后旗葉葉綠素?zé)晒鈪?shù)的動(dòng)態(tài)變化

隨著灌漿過程的進(jìn)行，10個(gè)春性小麥品種旗葉熒光參數(shù)整體呈現(xiàn)出前期平緩波動(dòng)后期急劇下降的趨勢，后期下降的速度存在品種間差異（圖4）。

圖4 不同品種春性小麥花后主莖旗葉熒光參數(shù)動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of chlorophyll fluorescence parameters of flag leaves on main stem of different spring wheat varieties after anthesis

無論是基于GLAD還是SPAD值，青春5號和寧春4號都屬于持綠型品種，晉麥2148和博愛7023都屬于非持綠型品種，通過比較（圖5）發(fā)現(xiàn)，在小麥花后25d時(shí)，持綠型小麥品種的ETR、Fv/Fm和qP均高于非持綠型品種，在小麥花后28d時(shí)，持綠型小麥品種的Fv/Fm和qP均高于非持綠型品種。

圖5 2種持綠類型小麥花后不同階段旗葉熒光參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of chlorophyll fluorescence parameters of flag leaves in different postanthesis stages of two types of wheats

2.4 不同品種春性小麥旗葉衰老過程中TaCLH和TaPPH的表達(dá)分析

從圖6可以看出，在10個(gè)春性小麥品種花后旗葉不斷衰老的過程中，旗葉葉綠素降解過程中與脫植基反應(yīng)相關(guān)的2個(gè)基因TaCLH與TaPPH的相對表達(dá)量有明顯的峰值和差值。TaCLH基因在花后旗葉衰老過程中相對表達(dá)量較低，其中品種寧春13號、內(nèi)麥19號、生選3號、綿陽15號、新春8號和寧春4號經(jīng)歷下降―上升―下降―上升―下降的過程，品種博愛7023、川麥22和青春5號經(jīng)歷下降―上升―下降的過程。TaPPH基因在旗葉衰老過程中相對表達(dá)量高于TaCLH基因，整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，峰值出現(xiàn)在22～25d，相對表達(dá)量最高的時(shí)段集中在花后16～28d。

圖6 不同品種春性小麥花后不同階段TaCLH和TaPPH相對表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes of TaCLH and TaPPH gene relative expression level of flag leaves on main stem of different spring wheat varieties after postanthesis

2.5 不同品種春性小麥花后旗葉 TaCLH、TaPPH相對表達(dá)量和生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表3可知，花后小麥旗葉葉綠素?zé)晒鈪?shù)Y(II)、Fv/Fm和ETR之間以及其與SPAD和GLAD值之間都具有極顯著的相關(guān)性。TaCLH與多數(shù)衰老相關(guān)生理指標(biāo)之間相關(guān)性不顯著，但是與TaPPH之間的正相關(guān)性卻達(dá)到顯著水平；TaPPH與SPAD、GLAD值及葉綠素?zé)晒鈪?shù) ETR、Fv/Fm、Y(II)之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即隨著花后衰老過程中TaPPH基因的表達(dá)這些生理指標(biāo)值會(huì)隨之下降。這說明TaCLH與TaPPH在旗葉衰老過程中可能為協(xié)同變化，共同影響旗葉的衰老過程。

表3 各性狀間的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients of traits

3 討論

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用所需的重要色素，研究[13]顯示，全球每年約有一百多噸葉綠素被降解。自20世紀(jì)90年代以來，在深入研究了葉綠素降解的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和酶基因后，葉綠素降解的過程才逐漸被人們熟知[14]。一段時(shí)間內(nèi)，葉綠素酶催化的脫植基反應(yīng)被認(rèn)為是葉綠素降解的第1步。Takamiya等[15]研究表明，葉綠素首先在CLH的作用下進(jìn)行脫植基反應(yīng)，再在MCS的作用下進(jìn)行脫鎂反應(yīng)，最后生成 Phein a。但這一結(jié)論受到廣泛爭議，Hirschfeld等[16]和Okazawa等[17]研究表明，在柑橘和銀杏等中CLH亞細(xì)胞定位于葉綠體膜內(nèi)葉綠素降解底物附近，而有研究[18-20]表明，擬南芥中CLH定位于葉綠體以外的細(xì)胞質(zhì)、液泡或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。隨著對葉綠素降解途徑的深入研究，PPH先后被人們挖掘出來，Schelbert等[8]和Ren等[21]分別運(yùn)用化學(xué)、遺傳學(xué)手段和聚類分析從擬南芥中鑒定到 PPH基因，Morita等[10]也從水稻中克隆鑒定到AtPPH的同源基因NYC3（NON-YELLOW COLORING 3）。PPH的發(fā)現(xiàn)為葉綠素降解代謝研究提供了另一條途徑，Chl a首先在MCS的作用下進(jìn)行脫鎂反應(yīng)，然后在 PPH的作用下進(jìn)行脫植基反應(yīng)，最后生成Phein a。

本文通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TaPPH的相對表達(dá)量與SPAD、GLAD及葉綠素?zé)晒鈪?shù)ETR、Fv/Fm和Y(II)之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即隨著花后衰老過程中TaPPH基因的表達(dá)，這些生理指標(biāo)值下降，說明TaPPH基因在花后旗葉衰老過程中對葉綠素含量、功能綠葉面積的下降及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化具有重要影響。而TaCLH與多數(shù)衰老相關(guān)生理指標(biāo)之間相關(guān)性不顯著，但TaCLH與TaPPH的相對表達(dá)量之間的相關(guān)性卻達(dá)到了極顯著水平。進(jìn)一步對小麥葉片衰老過程中TaCLH與TaPPH基因表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)葉綠素降解過程中與脫植基反應(yīng)相關(guān)的2個(gè)基因TaCLH與TaPPH的表達(dá)量都出現(xiàn)了顯著的峰值，但TaPPH總體表達(dá)顯著高于TaCLH。TaCLH在花后旗葉衰老過程中相對表達(dá)量較高的時(shí)間段集中于花后16～28d，且峰值出現(xiàn)在花后19～25d；TaPPH在旗葉衰老過程中相對表達(dá)量較高的時(shí)間段集中于花后16～28d，且峰值出現(xiàn)在花后22～25d。從聚類后的衰老特征參數(shù)來看，參試小麥品種的衰老起始與終止時(shí)間段在花后12～30d，且最大衰老速率時(shí)間出現(xiàn)在花后24～26d，這與TaCLH與TaPPH的高表達(dá)時(shí)間段和峰值出現(xiàn)時(shí)間基本一致。所有這些結(jié)果表明TaPPH在小麥葉片衰老葉綠素降解的脫植基過程中起主要作用，TaCLH可能與TaPPH通過互作行使功能，這需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

最新研究[22]表明，在幼嫩的擬南芥中葉綠素酶1（CLH1）在光系統(tǒng)的自我保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。而CLH1在擬南芥[23]、黑麥[24]和豆類[25]的幼葉中表達(dá)量顯著，隨著葉片成熟基因的表達(dá)量逐漸下降，推測葉綠素酶1基因主要是在作物生長發(fā)育前期起作用，而在小麥生長發(fā)育早期TaCLH是否起作用及如何發(fā)揮作用還需要進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

隨著花后小麥籽粒灌漿的進(jìn)行，參試的 10個(gè)春性小麥品種旗葉SPAD、GLAD及熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)ETR、Fv/Fm、Y(II)和qP隨著葉片衰老過程的進(jìn)行呈逐步降低的趨勢，且在各階段表現(xiàn)出品種間差異。基于花后SPAD和GLAD值的衰老特征參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，從參試品種中篩選出持綠型和非持綠型品種。參試小麥旗葉衰老過程中TaCLH與TaPPH都出現(xiàn)了顯著的高表達(dá)時(shí)間段，但TaPPH整體表達(dá)量顯著高于TaCLH。TaPPH表達(dá)量與GLAD、SPAD值及葉綠素?zé)晒鈪?shù)ETR、Fv/Fm和Y(II)等生理指標(biāo)之間存在極顯著負(fù)相關(guān)，表明TaPPH在春小麥花后旗葉葉綠素降解的脫植基過程中起主要作用。