胡婧文 趙穎

[摘要]目的研究不同產(chǎn)地半枝蓮藥材的 HPLC 指紋圖譜，以此作為半枝蓮的質(zhì)量評價方法。方法利用 HPLC 法，建立13個共有峰的半枝蓮指紋圖譜，計算相似度。進行聚類分析和主成分分析，對結(jié)果進行比較，初步篩選出質(zhì)量較好的批次藥材。結(jié)果采用指紋圖譜評價軟件計算出15批藥材相似度為0.930～0.992，聚類分析將15批藥材分為五類，主成分分析法綜合評價結(jié)果顯示 s1、s6和 s11所在產(chǎn)地的藥材質(zhì)量最好。結(jié)論該方法簡便、重復性較好，可用于半枝蓮藥材的質(zhì)量控制。

[關鍵詞]半枝蓮; HPLC;指紋圖譜;聚類分析;主成分分析

[中圖分類號] R284.1? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）07-0061-05

Study on fingerprint spectra of scutellariabarbata by clustering analysis and principal component analysis

HU? Jingwen??? ZHAO? Ying

Department of Pharmacy， Nanjing Hospital of Chinese Medicine， Jiangsu， Nanjing 210022， China

[Abstract] Objective To study the high-performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint spectra of the medicinal herb of scutellariabarbata from different origins， so as to evaluate the quality of scutellariabarbata. Methods Fingerprint spectra of 13 common peaks were established for scutellariabarbata by using HPLC method， and their similarity was calculated. Clustering analysis and principal component analysis （PCA） were performed to compare the results and initially screen out the batches of medicinal herbs with better quality. Results The similarity of 15 batches of medicinal herbs （0.930-0.992） was calculated with fingerprint spectra evaluation software. Meanwhile， the 15 batches of medicinal herbs were divided into five categories by clustering analysis， and the medicinal herbs with the origins of s1， s6 and s11 were comprehensively evaluated as of best quality by PCA. Conclusion The above method is simple， reproducible and can be used for the quality control of the medicinal herb of scutellariabarbata.

[Key words] Scutellariabarbata; HPLC; Fingerprint spectra; Clustering analysis; Principal component analysis

半枝蓮為唇形科植物半枝蓮（ScutellariabarbataD.Don）的干燥全草，具有清熱解毒、消腫止痛之功效，用于治療肝炎、咽喉腫痛等，外用治療疔瘡腫毒，毒蛇咬傷等[1]?，F(xiàn)代藥理學研究其具有治癌改善癥狀、破瘀止痛、解熱護肝的作用[2-5]。半枝蓮主產(chǎn)于江蘇、浙江等地，主要成分為黃酮類以及二萜類化合物[6-7]，還有多糖類、綠原酸、熊果酸、肉桂酸等成分[8-9]

文獻報道中對半枝蓮化學成分及含量的研究頗多[10]，指紋圖譜研究也有一些，但還未見通過相似度評價、聚類分析與主成分分析三者結(jié)合的方法評價不同產(chǎn)地半枝蓮質(zhì)量的文獻。馮華等[11]研究團隊通過生成 HPLC 指紋圖譜并結(jié)合聚類和主成分分析來監(jiān)測辣椒藥用原料的質(zhì)量;陳曉紅等[12]研究組建立了覆盆子指紋圖譜，并使用聚類和主成分分析選擇優(yōu)良的覆盆子品種，加強引種馴化，擴大種植規(guī)模，發(fā)展覆盆子產(chǎn)業(yè);吳玲芳等[13]通過指紋圖譜、聚類分析和主成分分析研究葉下珠的多酚部位。本研究采用高效液相色譜法結(jié)合“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件對半枝蓮指紋圖譜進行13個共同峰的相似度測定，使用 IBM SPSS Statistics 進行聚類和主成分分析，對三種方法的結(jié)果進行結(jié)合比較，初步篩選出產(chǎn)地質(zhì)量較好的半枝蓮藥材。

1儀器與試藥

1.1 儀器

waters 2695高效液相色譜儀（Waters Corporation， USA）、2998 DAD 檢測儀（Waters Corporation， USA）、AK-1000A 高速粉碎機（上海碩光電子科技有限公司）、KQ-300DE 型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）、MS205DU 十萬分之一電子天平（METTLER TOLEDO Group）。BBD11DA9-D321-468C-AF76-396C8FE1D907

1.2 試劑

甲醇為色譜純（江蘇漢邦公司），磷酸為分析純（南京化學試劑股份有限公司），水為怡寶純凈水（華潤怡寶中國有限公司），對照品野黃芩苷（中國食品藥品檢定研究院），批號為 MUST-19051310，純度為98.15%。

1.3? 藥材

15批半枝蓮藥材來源見表1。

2結(jié)果

2.1 試驗條件確立及樣品制備

2.1.1? HPLC 色譜條件Diamonsil C18（250×4.6 mm，5μm）色譜柱，流速：1.0 ml/min;柱溫：25℃;檢測波長：335 nm;進樣量：10μl;流動相：乙腈和0.1%磷酸水溶液。梯度洗脫，0～5min，15%～20%乙腈;5～45 min，20%～22%乙腈;45～60 min，22%～25%乙腈;60～70 min，25%～30%乙腈;70～90 min，30%～70%乙腈;90～95 min，70%～15%乙腈。

2.1.2 對照品溶液的制備取對照品野黃芩苷，精密稱取，用甲醇溶解稀釋，制成野黃芩苷濃度101.7μg/ml 的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備取半枝蓮粉末，精密稱取2 g，精密量取甲醇60 ml，置于具塞錐形瓶中，稱總重，超聲30 min，冷卻后再次稱量，用甲醇補足到超聲前總重，充分搖勻并過濾，取續(xù)濾液并通過0.45μm 微孔膜，即得。

2.2 方法學考察

2.2.1? 穩(wěn)定性試驗取同產(chǎn)地半枝蓮樣品，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，于0、4、6、12、18、24 h 依次進樣測定（進樣量10μl），記錄13個共有峰的保留時間和峰面積，經(jīng)計算，相對保留時間和峰面積的 RSD 均<3%，表明供試品溶液24 h 穩(wěn)定性較好。

2.2.2 精密度試驗取同一產(chǎn)地半枝蓮樣品，按“2.1.3”方法配制供試品溶液，連續(xù)進樣6次（進樣量10μl），結(jié)果相對保留時間和相對峰面積 RSD 均<3%，表明該儀器具有良好的準確度。

2.2.3 重復性試驗取同一產(chǎn)地半枝蓮樣品，按“2.1.3”方法制備6份供試品溶液，進樣并測定（進樣量10μl），結(jié)果各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均<3%，表明該測試方法的重現(xiàn)性良好。

2.3 指紋圖譜的建立

將15批半枝蓮樣品的相應數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統(tǒng)2012版”軟件。經(jīng)分析后，確立13個共同峰，建立指紋圖譜。其中2號峰峰面積較大，且分離度較好，因此將2號峰設為參照峰（野黃芩苷），結(jié)果見圖1～2。在共有峰的相對保留時間上，15批次之間差異較小，說明藥材的13種成分的出峰時間相對穩(wěn)定;相對保留面積差異較大，說明不同產(chǎn)地半枝蓮中相同的成分含量有較大差異。13個共有峰的相對保留時間和相對峰面積見表2～3。

2.4 相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”分析15批樣品數(shù)據(jù)，以樣品 s1為參照圖譜，選擇中位數(shù)法、多點校正，自動匹配生成對照指紋圖譜 R （見圖3），建立了15批樣品的指紋圖譜，進行相似度評價，相似評價結(jié)果為0.989、0.976、0.930、0.943、0.981、0.987、0.986、0.961、0.986、0.975、0.990、0.958、0.992、0.971、0.987，在0.930～0.992之間。說明各產(chǎn)地藥材有較好的相關性，差異性較小，此方法可用于評價半枝蓮藥材的整體質(zhì)量[14]。

2.5 聚類分析

本試驗采用 IBM SPSS Statistics 軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析，將各共有峰的峰面積作為變量，采用組間聯(lián)接法，以歐氏距離為測度，15批次半枝蓮樣品分析結(jié)果見圖4，樣品可聚為五類：s6、s11聚為一類， s4、s8、s13、s14、s15聚為一類， s2、s3、s7、s9、s10、s12 聚為一類，s1 和 s5 單獨為一類。同類藥材的相似度較高，差異較小。

2.6 主成分分析

將不同產(chǎn)地半枝蓮藥材的13個共有峰峰面積導入 IBM SPSS Statistics 軟件，對數(shù)據(jù)進行主成分分析，計算特征值、累積貢獻率、成分矩陣和綜合得分。2.6.1 特征值、貢獻率分析以特征值>1為提取標準[15]，確定了主成分1、2、3、4為半枝蓮藥材中13個共有峰的代表成分，4個主成分的累計貢獻率為84.431%，因此可代表所有成分進行分析，用來評價半枝蓮藥材的整體質(zhì)量。見表4。

2.6.2 成分矩陣根據(jù)系數(shù)大小可以判斷，主成分1主要來自2、3、4、6、7、8、10色譜峰，主成分2主要來自1、5色譜峰，主成分3主要來自9、12、13色譜峰。4個主成分與各個變量之間的相關系數(shù)見表5。

2.6.3 主成分得分、綜合得分分析根據(jù)4個主成分計算主成分得分和綜合得分，樣品 s1、s6、s11為綜合得分的前三名，說明這三批樣品質(zhì)量較好，主成分分析即篩選出具有代表性的共有成分進行計算評價。結(jié)果與相似度評價和聚類分析的結(jié)果一致。見表6。

3討論

中藥成分復雜，采用中藥指紋圖譜技術(shù)，能夠?qū)⒅兴幓瘜W成分的種類與數(shù)量較全面地反映出來，從而反映中藥的質(zhì)量和中醫(yī)用藥所體現(xiàn)的整體療效[16-17]。在色譜指紋圖譜分析中，無論是通過相關系數(shù)計算，還是通過矢量夾角余弦計算，都難以體現(xiàn)“量”的差異。即便圖譜較為相似，確定為同一品種，但相似度不高。而結(jié)合化學模式識別的方法可做出進一步的評價[18-19]。

聚類分析和主成分分析常應用于各種樣品的品質(zhì)鑒定與分類研究。聚類分析可用于判斷樣品之間的相似性，將相似的樣品歸為一類，主成分分析通過從每批藥材共有的化學成分中篩選出代表性和決定性的主成分，大致評價藥材的質(zhì)量[20-21]。本試驗確立了 HPLC 色譜檢測半枝蓮的方法，簡單易操作，準確性、重復性、穩(wěn)定性均較好，可作為半枝蓮質(zhì)量檢驗方法的參考。相似度評價、聚類分析和主成分分析三者相輔相成，從圖形和量上對藥材指紋圖譜進行分析更具有說服力。但是中藥成分復雜，需要液相質(zhì)譜聯(lián)用及紫外、紅外分析等更多的技術(shù)手段來評價各地藥材的質(zhì)量。本試驗聚類分析中歸為一類的樣品在主成分分析中的排名也是靠近的，說明兩種分析方法的結(jié)果較為一致。但是主成分分析排名結(jié)果主要由幾種含量較多的成分來決定，前期進行15批藥材中野黃芩苷含量的測定，野黃芩苷含量的多少與主成分分析排名結(jié)果一致。中藥成分復雜，還有很多含量較少但有藥理學作用的成分存在，所以不建議只采取一種分析方法，需要多種分析方法聯(lián)合使用。BBD11DA9-D321-468C-AF76-396C8FE1D907

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：122-123.

[2]? Li HW， Jiu ML， Wei X， et al.ScutellariabarbataD.doninhibits tumor angiogenesis via suppression of hedgehog pathway in a mouse model of colorectal cancer[J].Int J Mol Sci，2012，13（8）：9419-9430.

[3] 范菊娣，覃容貴，張玨，等.主成分和聚類分析法對不同產(chǎn)地半枝蓮的綜合質(zhì)量評價[J].中國試驗方劑學雜志，2016，22（23）：40-44.

[4] 楊敏娟，羅宇琴，官永河，等.基于超高效液相色譜指紋圖譜和主成分分析法評價不同主產(chǎn)地半枝蓮的質(zhì)量[J].世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2019，21（10）：2247-2252.

[5] Jifeng LI. Study on Infrared Fingerprint of Sculellariabrbata[J].Agricultural Science & Technology，2017，18（12）：2561-2562.

[6] 任強.半枝蓮化學成分及藥理作用研究進展[J].濟寧醫(yī)學院學報，2014，37（3）：157-161.

[7] 金順琪，張露蓉，李曼，等.半枝蓮 HPLC 指紋圖譜的建立及9種黃酮類成分含量測定[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2006，17（18）：1-10.

[8] 李娜，王平，孫鐵鋒，等.半枝蓮化學成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進展[J].中國中藥雜志，2020，45（21）：5117-5128.

[9] 付小凱，劉勇，李陽，等.HPLC 同時測定半枝蓮中對香豆酸和肉桂酸的含量[J].中國試驗方劑學雜志，2016，22（3）：44-47.

[10]王慧彬，王英鋒，劉鎖蘭.半枝蓮的 HPLC 指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志，2007（6）：847-885.

[11]馮華，王祥培，王世俊，等.辣椒藥材的 HPLC 指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析[J].中國藥房，2019，30（8）：1078-1082.

[12]陳曉紅，岳顯可.基于聚類分析和主成分分析浙產(chǎn)覆盆子 HPLC 指紋圖譜研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2018，25（3）：350-354.

[13]吳玲芳，林琛，崔雅萍，等.基于聚類分析和主成分分析的葉下珠多酚部位 HPLC 指紋圖譜研究[J].世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（11）：2285-2289.

[14]聶韡，朱培林，房海靈，等.HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學計量學評價不同產(chǎn)地廣東紫珠藥材的質(zhì)量[J].中草藥，2017，48（1）：185-191.

[15]張茹萍，何昱，石森林，等.HPLC 指紋圖譜結(jié)合主成分分析評價不同產(chǎn)地雷公藤藥材質(zhì)量[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2014，31（11）：1338-1344.

[16]臧玉豹，馬子君.氣滯胃痛丸中間體指紋圖譜研究[J].中國醫(yī)藥科學，2021，11（5）：61-63，67.

[17]劉文，蔣世云.中藥指紋圖譜研究與應用進展[J].中國藥房，2011，22（19）：1819.

[18]王慧彬.半枝蓮指紋圖譜及成分研究[D].北京：首都師范大學，2007：25.

[19]錢浩泉，謝培山.中藥液相色譜指紋圖譜的方法學研究一銀杏葉總黃酮指紋圖譜個例剖析[J].分析測試學報，2004，23（5）：7-11.

[20]吳玲芳，林琛，袁永兵，等.葉下珠指紋圖譜及模式識別研究[J].中草藥，2015，46（4）：572-575.

[21]張煜炯，彭昕，吉慶勇.聚類分析和主成分分析法研究三葉青氯仿部位 HPLC 指紋圖譜[J].中成藥，2016，38（3）：607-612.

（收稿日期：2021-09-17）BBD11DA9-D321-468C-AF76-396C8FE1D907