孔麗蕊，何大海，周朝瓊，李鴻釧，吳風(fēng)，羅建偉，張艷

(四川省成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都，611730)

腎臟疾病的發(fā)病率和病死率與腎損傷程度密切相關(guān)，而腎功能測量指標(biāo)在腎臟疾病的診斷、監(jiān)測以及治療方面起重要作用，常用于評估腎臟疾病的風(fēng)險或監(jiān)測腎損傷患者的損傷程度。生物標(biāo)志物的生物學(xué)變異數(shù)據(jù)是臨床醫(yī)生判斷患者健康與否以及疾病診斷、治療、預(yù)后的重要依據(jù)。目前國內(nèi)外對腎損傷血清標(biāo)志物生物學(xué)變異研究尚不全面，主要為疾病狀態(tài)下日間生物學(xué)變異[1-3]，尚沒有對健康群體短期內(nèi)生物學(xué)變異進(jìn)行規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的研究報道。本研究對31名健康志愿者采用新一代的分析方法測定24 h內(nèi)s-CREA，s-β2MG，s-Cys C，s-NGAL的水平，并對腎損傷血清標(biāo)志物24 h內(nèi)的短期生物學(xué)變異數(shù)據(jù)進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

樣本來源于成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院2019年3月至11月31名健康志愿受試者，其中，男性17名(中位年齡30歲，范圍21～54歲)，女性14名(中位年齡33歲，范圍18～48歲)。身高、體重、血壓、心率、男女性別等構(gòu)成比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：無慢性糖尿病、高血壓、甲狀腺腫、心腦血管等疾病，無用藥史，有穩(wěn)定的生活。所有參與者均完成問卷調(diào)查，以驗(yàn)證其健康狀況并收集有關(guān)生活方式的信息，并進(jìn)行相關(guān)體檢測試，以確保滿足所有納入標(biāo)準(zhǔn)[4]。對符合條件的受試者，保持采血當(dāng)日正常的飲食(8：00，12：00，19：00)和正常的休息。研究方案經(jīng)成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得每位參與者的書面知情同意。

1.2 方法

以4 h為時間點(diǎn)間隔(0，4，8，12，16，20 h)，24 h內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化采集6份血液樣本。樣本收集歷時9個月(2019年3月至11月)。血液采集后室溫放置30 min，待全血樣本自然析出血清后，5 000 r/min離心10 min，血清移入Eppend 管，保存于-70 ℃冰箱中待檢。

所有標(biāo)本在室溫下解凍，采用四川省邁克實(shí)業(yè)有限公司提供的試劑在日立7180全自動生化分析儀上統(tǒng)一測定。檢測前對分析儀按照制造商說明進(jìn)行校準(zhǔn)，參與者的所有樣品均進(jìn)行2次測定。s-β2MG，s-Cys C，s-NGAL采用膠乳免疫比濁法測定。s-CREA采用特異性高的肌氨酸氧化酶法測定，方法測量值可以溯源到肌酐測定的最高標(biāo)準(zhǔn)ID-MS方法，測定性能可以滿足臨床要求。內(nèi)部質(zhì)量控制使用2個水平的質(zhì)控品，CREA批號為48811/45813，由美國伯樂公司提供；β2MG，Cys C批號為68912，NGAL批號為0619021，由四川省邁克實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用student-t檢驗(yàn)對男女組平均值的差異進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。用Shapiro-Wilk試驗(yàn)驗(yàn)證測試數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，采用Dixon WJ準(zhǔn)則處理數(shù)據(jù)離群值，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對研究變量的性別相關(guān)差異進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。CVA為同一分析批中重復(fù)測定數(shù)據(jù)獲得，CVI和CVG采用具有95%置信區(qū)間的嵌套方差分析進(jìn)行計算，個體指數(shù)(II)和參考變化值(RCV)的計算公式為

II=CVI/CVG。

2 結(jié)果

2.1 腎損傷血清標(biāo)志物的變化

31名受試者均完成了24 h內(nèi)6次樣本收集，共186份血液樣本。經(jīng)重復(fù)測量后，有372個結(jié)果可分析。如方法部分所述，對每個分析物分別進(jìn)行離群值檢測，其中28號s-β2MG被排除在外。腎損傷血清標(biāo)志物24 h內(nèi)濃度呈偏態(tài)分布，血清標(biāo)志物濃度變化見圖1。

圖1 不同性別的腎損傷血清標(biāo)志物水平分布Fig.1 Distribution of levels of kidney injury biomarkers in men and women

2.2 不同采集時間點(diǎn)、不同性別腎損傷血清標(biāo)志物水平比較

24 h內(nèi)不同采集時間點(diǎn)(0，4，8，12，16，20 h)、不同性別間腎損傷血清標(biāo)志物s-CREA,s-β2MG,s-Cys C，s-NGAL水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 不同采集時間點(diǎn)的腎損傷血清標(biāo)志物水平Table 1 Levels of kidney injury markers detected at different collection time points

2.3 24 h內(nèi)腎損傷血清標(biāo)志物水平與性別的關(guān)系

24 h內(nèi)腎損傷血清標(biāo)志物水平與性別進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 不同性別24 h內(nèi)腎損傷血清標(biāo)志物水平比較Table 2 Comparison of the concentration levels of kidney injury biomarkers within 24 h between the

2.4 腎損傷標(biāo)志物的BV，RCV和II

腎損傷血清標(biāo)志物的Mean，CVA，CVI，CVG，RCV和II，男女之間表現(xiàn)出個體差異。見表3。

表3 24 h內(nèi)腎損傷血清標(biāo)志物的Mean，CVA，CVI，CVG，RCV和IITable 3 Mean，CVA，CVI，CVG，RCV and II with 95% confidence intervals of the kidney injury biomarkers within 24 h

2.5 CVI，CVG估計值比較

本研究CVI，CVG高于EFLM和歷史生物學(xué)變異數(shù)據(jù)庫中報告的CVI，CVG估計值，見表4。

表4 生物學(xué)變異CVI，CVG估計值比較Table 4 Comparison of the CVI and CVG estimates of the biological variants

3 討論

生物學(xué)變異數(shù)據(jù)的廣泛應(yīng)用，對測定血清標(biāo)志物的穩(wěn)態(tài)性和質(zhì)量提出了較高的要求。歐洲臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,EFLM)對血清標(biāo)志物不同研究組的生物學(xué)變異估計值進(jìn)行薈萃分析，并不斷完善生物學(xué)變異數(shù)據(jù)關(guān)鍵評價清單(biological variation data critical appraisal checklist，BIVAC)[5]，建立了人體生物標(biāo)志物的生物學(xué)變異數(shù)據(jù)庫，用于解釋臨床試驗(yàn)結(jié)果和定義分析性能規(guī)范(analytical performance specifications，APS)[6-7]。本研究采用EFLM標(biāo)準(zhǔn)和最新檢測方法對受試者進(jìn)行篩查分析。

本研究發(fā)現(xiàn)受試者腎損傷血清標(biāo)志物24 h內(nèi)濃度呈偏態(tài)分布，不同采樣時間點(diǎn)間腎損傷血清標(biāo)志物水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而男性和女性的水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CVA由實(shí)驗(yàn)室重復(fù)測定數(shù)據(jù)獲得，消除了批間分析變異，且確保分析變異的基質(zhì)穩(wěn)定。除s-Cys C 外，s-CREA，s-β2MG，s-NGAL的 CVA明顯小于1/2 CVI，說明日立7180生化分析儀測定方法分析變異較小，計算的RCV對連續(xù)結(jié)果的監(jiān)測是可靠的。而s-Cys C的CVA>1/2CVI，將增加RCV的假陽性結(jié)果，后期判讀結(jié)果時需特別注意。

31名受試者24 h內(nèi)腎損傷血清標(biāo)志物的CVI穩(wěn)定在5%～10%，無性別方面的差異，表明機(jī)體代謝處于穩(wěn)定狀態(tài)，可能與血清樣本濃度源自產(chǎn)生和清除之間的平衡有關(guān)。JONKER等[8]曾報道血清肌酐采樣間隔之間CVI無明顯差異。本研究4種血清標(biāo)志物生物學(xué)變異數(shù)據(jù)CVI，CVG均高于網(wǎng)站公布數(shù)據(jù)[9]。s-CREA受腎小管分泌、肌肉質(zhì)量、年齡與性別的影響，同時，本研究采用標(biāo)準(zhǔn)化的酶法進(jìn)行CREA水平測定，s-CREA結(jié)果較堿性苦味酸法測定結(jié)果普遍降低，可能會導(dǎo)致生物學(xué)變異數(shù)據(jù)在理論上高于標(biāo)準(zhǔn)化前研究報告的生物學(xué)變異估計數(shù)據(jù)。s-β2MG，s-Cys C采用免疫比濁法進(jìn)行測定，除地域環(huán)境影響外，方法學(xué)是否影響CVI，CVG還有待進(jìn)一步研究。s-CREA，s-β2MG，s-Cys C的CVG>CVI，對檢測結(jié)果進(jìn)行判讀時，需要進(jìn)行針對性別的CVG估算。NGAL是近年來發(fā)現(xiàn)的早期診斷腎損傷的新型生物學(xué)標(biāo)志物，具有早期、快速、特異性高、敏感性高、受其他因素影響少的優(yōu)點(diǎn)，引起了人們的廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是“腎臟的肌鈣蛋白”，可以預(yù)測慢性腎臟病的進(jìn)展，獨(dú)立于其他潛在的危險因素[10-11]。本研究中s-NGAL 的CVI和CVG分別為11.64%(10.44%～13.16%)和22.20%(17.74%～29.68%)。

個體變異性及參考值的關(guān)系可以用II表示，II=CVI/ CVG。當(dāng)II>1.4時,表示該檢驗(yàn)項(xiàng)目個體專一性低，個體間變異小于個體本身變異，任何微小的生理狀態(tài)變動就會造成指標(biāo)超過參考值范圍，適用于人群篩檢。當(dāng)II<0.6時,表示該檢驗(yàn)指標(biāo)個體專一性高，個體間變異大于個體本身變異，參考區(qū)間的參考價值有限，患者可能已經(jīng)為異常結(jié)果卻還落在正常參考值范圍之內(nèi)。本研究的所有檢測指標(biāo)II均<0.6，提示腎功能指標(biāo)的個體特異性較高，個體檢測值的分布只出現(xiàn)在區(qū)間范圍的一小部分，運(yùn)用生物學(xué)變異來進(jìn)行結(jié)果評價較為合適。所以，醫(yī)生在運(yùn)用傳統(tǒng)參考區(qū)間來解釋腎功能結(jié)果時，還應(yīng)該考慮到個體內(nèi)結(jié)果的波動，當(dāng)個體因疾病發(fā)生了變化，其結(jié)果在數(shù)值上的差異應(yīng)該大于2次測定結(jié)果的固有變異值RCV。

由于2個檢驗(yàn)結(jié)果中存在生物學(xué)變異和分析變異，其結(jié)果之間的數(shù)值差值為固有變化值之和，稱為RCV[6,12-13]。在評估檢測結(jié)果的變化時，當(dāng)連續(xù)檢測結(jié)果之間的差異超過RCV時，即使結(jié)果仍在參考區(qū)間內(nèi)，結(jié)果的變化仍具有臨床意義。本研究血清樣本II<0.6，經(jīng)典參考值不適用于評估它們的結(jié)果，應(yīng)選擇RCV進(jìn)行結(jié)果判讀。如s-CREA首次檢測為60.4 μmol/L，第2次檢測為110.4 μmol/L，根據(jù)傳統(tǒng)參考區(qū)間判斷，患者結(jié)果都在參考區(qū)間內(nèi)，實(shí)際血清水平增加了50 μmol/L(RCV為21.88%)，腎功能可能出現(xiàn)了問題。如果兩次檢測結(jié)果比較小于本實(shí)驗(yàn)室的RCV值，即使超出參考值范圍，都不必立即確定該結(jié)果異常，建議數(shù)天后復(fù)查。為每個患者定義一個獨(dú)特的個性化參考區(qū)間[14]以指導(dǎo)其臨床治療，被證明既繁瑣又昂貴，所以，通過前后結(jié)果差異是否大于RCV來判斷可能更適合。本研究血清s-CREA,s-β2MG,s-Cys C,s-NGAL的RCV分別為21.88%，29.31%，5.32%，33.09%。

總之，本研究為腎損傷血清標(biāo)志物s-CREA，s-β2MG，s-Cys C，s-NGAL提供了健康人群24 h內(nèi)的生物變異數(shù)據(jù)。CVG>CVI，個體指數(shù)II<0.6，腎損傷血清標(biāo)志物根據(jù)RCV進(jìn)行臨床決策更有臨床應(yīng)用價值。