左遨勛，劉積光，高玉梅，劉平懷

（海南大學(xué)，海南 ?？?570228）

丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）屬桃金娘科植物，是原產(chǎn)于印度尼西亞的一種香料[1]?，F(xiàn)已在世界各地廣泛種植，主要有印度尼西亞、桑給巴爾和馬達(dá)加斯加島[2]。丁香是中國(guó)的傳統(tǒng)進(jìn)口“南藥”之一，我國(guó)從20世紀(jì)50年代開始引種，目前在海南、廣東、云南等地均有栽培[3]。植物揮發(fā)油，也叫植物精油，是一種次生代謝物質(zhì)，通常從芳香植物中提取[4]。在我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)實(shí)踐中，醫(yī)食同源的理念一直貫穿于其中，現(xiàn)在研究表明，丁香花蕾含有揮發(fā)油，油中主要含丁香酚、丁香油酸、乙酰丁香油酸及丁香烯、甲基正戊酮、甲基正庚酮、香莢蘭醛等成分。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)丁香揮發(fā)油的研究多集中于丁香花蕾，缺乏對(duì)丁香其他部位的揮發(fā)油的研究。為了全面開發(fā)丁香全植株，本文通過水蒸氣蒸餾法提取丁香4個(gè)不同部位的揮發(fā)油，并通過氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）法鑒定丁香花蕾、丁香果實(shí)、丁香葉和丁香枝揮發(fā)油的化學(xué)成分，并研究丁香4個(gè)不同部位揮發(fā)油的抗氧化活性，填補(bǔ)了丁香全株揮發(fā)油抗氧化活性研究方面的空白，為后續(xù)綜合利用丁香全植株揮發(fā)油提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁香花蕾：中國(guó)廣西省藥材市場(chǎng)；丁香果實(shí)：中國(guó)海南省三亞市藥材市場(chǎng)；丁香枝、丁香葉：采自海南省興隆熱帶植物園，采集的樣品為帶葉小枝，隨后枝葉分離，自然風(fēng)干。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、過硫酸鉀、三氯乙酸：上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、三氯化鐵：西隴化工股份有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、鐵氰化鉀：上海源葉生物科技有限公司；2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-striazine，TPTZ]：上海阿拉丁生化科技有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Trace 1300）：美國(guó)賽默飛世爾公司；紫外可見分光光度計(jì)（TU-1810PC）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（Smart S-15）：上海和泰儀器有限公司；酶標(biāo)儀（xMark）：BIO-RAD 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV10plus）：艾卡儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)油的制備

丁香4個(gè)部位揮發(fā)油采用重?fù)]發(fā)油提取裝置[5-6]，經(jīng)水蒸汽蒸餾法提取，料液比為1∶8（g/mL），各部位提取的揮發(fā)油具有濃郁的香氣，由花蕾部位得到占樣品總質(zhì)量12%的淡黃色透明揮發(fā)油，由果實(shí)部位得到占樣品總質(zhì)量2%的黃色透明揮發(fā)油，由枝部位得到占樣品總質(zhì)量0.9%的黃色透明揮發(fā)油，由葉部位得到占樣品總質(zhì)量2.8%的黃色透明揮發(fā)油。

1.3.2 化學(xué)分析

1.3.2.1 氣相色譜條件

氣相色譜檢測(cè)條件：色譜柱Agilent 122-5532UI，DB-5ms Ultra Inert，30 m×250 μm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度250 ℃，柱前壓 48.27 kPa，進(jìn)樣量 1 μL，載氣（He）流量1 mL/min，分流15 mL/min。程序升溫：起始溫度40℃，保持1min，以40℃/min升溫至120℃，以5℃/min升溫至240℃，最后以12℃/min升溫至300℃，保持6min。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜檢測(cè)條件：電子轟擊離子源電離方式，電子能量70 eV，接口溫度280℃，離子源溫度250℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～350。

1.3.3 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.3.1 DPPH·清除能力測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[7]，稍作修改。配制質(zhì)量濃度為60μmol/L DPPH-乙醇溶液，加入0.5 mL丁香不同部位揮發(fā)油，置于陰暗處反應(yīng)30 min，乙醇調(diào)零后在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)量吸光度，陽性對(duì)照為VC，DPPH·清除率計(jì)算公式如下。

式中：A0為0.5 mL乙醇+4.5 mL DPPH的吸光度；A1為0.5 mL供試品+4.5 mL乙醇的吸光度；A2為0.5 mL供試品+4.5 mL DPPH的吸光度。

1.3.3.2 ABTS+·清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8-9]，取質(zhì)量濃度為7 mmol/L的ABTS溶液和質(zhì)量濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液，按相同體積混合，避置于陰暗處反應(yīng)24 h，稀釋后使ABTS混合液吸光值為0.700±0.050；取1.9 mL ABTS混合液加入50 μL乙醇稀釋的不同濃度的丁香揮發(fā)油，置于暗處反應(yīng)6 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)量吸光度，陽性對(duì)照為VC，ABTS+·清除率計(jì)算公式如下。

式中：A1為樣品組吸光度；A2為對(duì)照組吸光度。

1.3.3.3 還原力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10-11]，取0.5 mL樣品，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS溶液（pH6.6）、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，充分混合。將混合后的溶液放置在50℃水浴鍋中反應(yīng)25 min，再向離心管中加入2.5 mL三氯乙酸溶液，充分混合后離心；吸取上層澄清液體2.5 mL加入2.5 mL蒸餾水、0.5mL 0.1%三氯化鐵溶液，搖勻后反應(yīng)10 min；最后在700nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以此表征還原力。

1.3.3.4 鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]，取2.5 mL 20 mmol/L的FeCl3溶液、10 mmol/L TPTZ溶液與300 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH3.6）按照體積比 1∶1∶10 混合；吸取各濃度混合液于593 nm下測(cè)定吸光度A1；加入20 μL稀釋到適宜濃度的提取液，反應(yīng)10 min，測(cè)定吸光度A2。計(jì)算反應(yīng)后吸光度減去反應(yīng)前的吸光度的數(shù)值A(chǔ)0，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到該提取液吸光值A(chǔ)0對(duì)應(yīng)的FeSO4濃度，此濃度即FRAP值。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.000 6x+0.099 8，線性范圍 0～3 000 μmol/L（R2=0.999 8）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 22.0和Origin 9.64軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)試驗(yàn)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油GC-MS分析

表1比較了經(jīng)GC-MS測(cè)定的丁香不同部位揮發(fā)油的成分及含量。

表1 丁香不同部位揮發(fā)油成分GC-MS分析Table 1 GC-MS analysis of volatile oil of different parts of clove

從丁香花蕾、果實(shí)、葉、枝中得到含量為12%、2%、2.8%、0.9%的淺黃色透明揮發(fā)油，皆具有濃香味。由表1可知，丁香4個(gè)不同部位揮發(fā)油共鑒定出43種化學(xué)成分，其中倍半萜類為 α-依蘭烯、β-石竹烯、（Z，Z，Z）-1，1，4，8-四甲基-4，7，10-環(huán)十烯丙烯、葎草烯、β-胡椒烯、β-依蘭烯、菖蒲醇、1，2，3，4，4a，7-六氫-1，6-二甲基-4-（1-甲基乙基）萘、反-Z-α-環(huán)氧化紅沒藥烯、石竹素、葎草烯環(huán)氧化物II、庫貝醇、順-Z-α-環(huán)氧化紅沒藥烯、caryophylla-4（12），8（13）-dien-5α-ol、α-蒎 烯、tau.-cadinol、（1R，7S，E）-7-isopropyl-4，10-dimethylenecyclodec-5-enol、異香橙烯環(huán)氧化物；炔酯類有 12，15-octadecadiynoic acid，methyl ester、10-heptadecen-8-ynoic acid，methyl ester，（E）-、8，10-十八碳二炔酸甲酯、5，7-十六烯酸甲酯、2，5-十八碳二炔酸甲酯、9，11-十八碳二炔酸甲酯、4，6-十四碳二炔酸甲酯；烯酯類為 4，7，10，13-十六烯酸甲酯、順-8，11，14，17-二十碳四烯酸甲酯；酚類有4-烯丙基苯酚、丁香酚、2-甲氧基-5-（1-丙烯-1-基）苯酚；醚類為2-烯丙基-1，4-二甲氧基苯、tricyclo[20.8.0.0（7，16）]triacontane，1（22），7（16）-diepoxy-；此外還有少量的酚酯、烯烴、二萜、芳香酮、脂肪酸、醇類等物質(zhì)。其中丁香酚、β-石竹烯、乙酰丁香酚、2，5-十八碳二炔酸甲酯、9，11-十八碳二炔酸甲酯、司骨化醇、10-heptadecen-8-ynoic acid，methyl ester，（E）-為丁香不同部位揮發(fā)油的7個(gè)共有成分。

丁香酚、β-石竹烯、乙酰丁香酚作為丁香不同揮發(fā)油的共有成分，這3種成分在丁香花蕾中的總比例為94.22%，在丁香果實(shí)中的總比例為66.40%，在丁香葉中的總比例為86.30%，在丁香枝中的總比例為56.06%，相對(duì)含量均達(dá)到50%以上，且在丁香葉中的含量與丁香花蕾中的含量比較接近。但丁香葉和丁香果實(shí)的主要成分種類更接近，都含有較高比例的2'，3'，4'-三甲氧基苯乙酮，而丁香花蕾和丁香枝中則沒有此成分。丁香枝揮發(fā)油檢出的成分種類最少，但其中的異檸檬酸乙酯是丁香果實(shí)不具有的，正三十七烷醇是丁香葉揮發(fā)油不具有的。

2.2 抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.2.1 DPPH·清除能力

圖1比較了丁香不同部位揮發(fā)油與VC的DPPH·清除能力。

圖1 丁香不同部位揮發(fā)油與VC的DPPH·清除能力Fig.1 DPPH·scavenging ability of volatile oil of different parts of clove and VC

由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，DPPH·的清除率與濃度有良好的量效關(guān)系。隨著丁香揮發(fā)油濃度的增加，DPPH·清除率也隨之增加。根據(jù)擬合曲線，VC、丁香葉、丁香花蕾、丁香果實(shí)和丁香枝的DPPH自由基清除能 力的 IC50值分別為 （2.51±0.12）、（21.37±0.32）、（37.35±0.82）、（98.18±0.50）、（28.14±0.46）μg/mL。在0～64.23 μg/mL，丁香枝的DPPH·清除率高于丁香花蕾；在 64.23 μg/mL～700 μg/mL，丁香花蕾的 DPPH·清除率高于丁香枝。丁香葉的DPPH·清除率最高但低于VC，丁香果實(shí)的DPPH·清除率最低。

2.2.2 ABTS+·清除活性

丁香不同部位揮發(fā)油與VC的ABTS+·清除能力見圖2。

圖2 丁香不同部位揮發(fā)油與VC的ABTS+·清除能力Fig.2 ABTS+·scavenging ability of volatile oil of different parts of clove and VC

由圖2可知，ABTS+·清除率隨著丁香揮發(fā)油濃度的增加而增加。VC、丁香葉、丁香花蕾、丁香果實(shí)和丁香枝 ABTS+·清除率的 IC50值分別為 （47.77±0.87）、（117.32±0.63）、（139.48±0.76）、（244.99±1.21）、（141.61±0.84）μg/mL。在較低的濃度下，丁香花蕾和丁香枝ABTS+·清除率接近。整體上，ABTS+·清除率大小順序依次為VC＞丁香葉＞丁香花蕾＞丁香枝＞丁香果實(shí)，說明丁香不同部位揮發(fā)油均具有良好的ABTS+·清除活性。

2.2.3 還原力

圖3比較了丁香不同部位揮發(fā)油與VC的還原力。

圖3 丁香不同部位揮發(fā)油與VC的還原力Fig.3 Reducing power of volatile oil of different parts of clove and VC

還原力常被用作供電子活性的標(biāo)準(zhǔn)，這是測(cè)試酚類化合物抗氧化作用的重要機(jī)制[13]。還原力也被用作檢測(cè)中藥材抗氧化活性的重要指標(biāo)[14-15]。由圖3可知，丁香葉、丁香花蕾、丁香果實(shí)、丁香枝和VC的還原力都隨著濃度的增加而增大，大小順序依次為VC＞丁香葉＞丁香花蕾≈丁香枝＞丁香果實(shí)，表明丁香的這些部位都有較好的還原力。

2.2.4 FRAP值

丁香不同部位揮發(fā)油與VC的FRAP值見圖4。

圖4 丁香不同部位揮發(fā)油與VC的FRAP值Fig.4 FRAP values of volatile oil of different parts of clove and VC

研究發(fā)現(xiàn)，生物活性化合物的供電子與抗氧化活性有關(guān)[16-17]?；衔锏倪€原力可以作為其潛在抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)。在有還原劑（如抗氧化劑）存在的情況下，F(xiàn)e3+/鐵氰化物復(fù)合物會(huì)被還原成亞鐵形式的抗氧化劑[18]。圖4顯示，F(xiàn)RAP值隨著濃度的增加而增大。VC的FRAP值最大，其次是丁香葉，而丁香花蕾和丁香枝表現(xiàn)出近似的FRAP值，丁香果實(shí)最低。在測(cè)量的濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)RAP值與質(zhì)量濃度有良好的量效關(guān)系，表明丁香不同部位揮發(fā)油具有較強(qiáng)的鐵離子還原能力。

3 結(jié)論

總的來說，丁香不同部位揮發(fā)油含有多種相同的成分，丁香酚、β-石竹烯、乙酰丁香酚3種主要成分的總含量都在50%以上，表明了丁香各部位揮發(fā)油均具有較高的研究?jī)r(jià)值，而丁香枝揮發(fā)油成分種類與其他3個(gè)部位有較大的差異。

抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，丁香揮發(fā)油具有顯著的抗氧化活性，這可能與丁香酚和乙酰丁香酚等酚類化合物的含量較高有關(guān)。通過與對(duì)照組VC的比較可以得出，丁香葉、丁香花蕾、丁香果實(shí)和丁香枝的揮發(fā)油均具有良好的抗氧化性能。因此，從丁香不同部位中提取的揮發(fā)油可以作為一種天然抗氧化劑，在食品、藥品的長(zhǎng)期儲(chǔ)存等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。