王曉藝，李培坤，李錦紅，杜英杰，邊紅杰，賈士儒，崔建東*

（1.天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018）

玫瑰是薔薇科植物，又稱刺玫瑰、穿心玫瑰、筆頭花等[1]，具有良好的食用價(jià)值。而重瓣玫瑰是一種被廣泛食用的玫瑰，花瓣香甜、香氣馥郁，有疏肝理氣、活血散瘀、美容養(yǎng)顏等多種功效，含有多種活性物質(zhì)，如多酚、多糖、有機(jī)酸等[2]。因此，玫瑰花中活性物質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用前景。多酚是一種生物活性物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，按結(jié)構(gòu)可以分成酚酸類、類黃酮類和1，2-二苯乙烯及木酚素類[3-4]，由于多酚結(jié)構(gòu)的特殊性，使其具有很好的抗氧化、抗衰老、抑菌等作用[5-7]。因此，將玫瑰花中的多酚提取出來進(jìn)行綜合利用受到學(xué)者廣泛關(guān)注。目前，有機(jī)溶劑提取法和水浴加熱浸提法是提取多酚的常用方法[8]。但是傳統(tǒng)方法需要使用大量有機(jī)溶劑且提取時(shí)間長、操作復(fù)雜，不符合綠色化學(xué)的概念，在環(huán)保性和安全性上存在缺陷。因此，尋找一種綠色、環(huán)保且高效的植物多酚提取方法是十分必要的。

2003 年，低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）的概念首次被提出[9]，DES是一種新型的綠色溶劑，是由氫鍵供體和氫鍵受體組成的兩組分或三組分低共熔混合物，其熔點(diǎn)比各個(gè)組分更低[10]，具有良好的特性，如無毒、易于合成、成本低、生物可降解性等，已被公認(rèn)為是傳統(tǒng)溶劑替代品[11]。Bajkac等[12]利用DES從大豆中提取異黃酮等活性物質(zhì)。Ozturk等[13]利用DES從橙皮廢料中提取多酚類抗氧化劑。因此，DES在活性物質(zhì)的提取方面具有較好的應(yīng)用前景[14]。超聲輔助提取可以在較好地保持提取物的結(jié)構(gòu)和活性的同時(shí)，使植物細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)快速釋放、擴(kuò)散并進(jìn)入到提取劑中，具有省時(shí)、高效等特點(diǎn)[15-16]。因此，利用超聲輔助DES法提取植物中的活性物質(zhì)可能會增強(qiáng)提取效果。

本文以盛產(chǎn)于河北省衡水市的重瓣玫瑰“豐花1號”為原料，采用超聲輔助DES法提取其中的多酚，運(yùn)用單因素試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并與傳統(tǒng)乙醇提取方法進(jìn)行比較，利用NKA-9大孔吸附樹脂分離純化多酚，并研究純化后多酚的抗氧化活性。本文將為玫瑰多酚的綠色提取提供新思路，為其在天然抗氧化劑領(lǐng)域中的應(yīng)用中提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花（重瓣玫瑰“豐花1號”）：產(chǎn)自河北衡水，60℃烘箱干燥6 h后粉碎過80目篩備用。

氯化膽堿：上海晶純生化科技股份有限公司；乳酸：上海源葉生物科技有限公司；維生素C、福林酚、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2，2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]、無水碳酸鈉：上海麥克林生化科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平（ME204）：梅特勒-托利多儀器有限公司；集熱式磁力加熱攪拌器（DF-Ⅱ）：江蘇金怡儀器科技有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-5100）：上海元析儀器有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（Scientz-ⅡD）：寧波新芝生物科技股份有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（FD-1）：上海田楓實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玫瑰多酚提取工藝流程

玫瑰花粉末→加入提取劑→混勻→超聲輔助提取→離心→取上清液。

1.3.2 多酚含量的測定

利用福林酚比色法[17]測定多酚含量：取不同質(zhì)量濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（10、20、30、40、50 μg/mL）、水和樣品溶液1.0 mL，分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%的福林酚試劑 5.0 mL，靜置 3 min～8 min，再加入 7.5 g/100 mL碳酸鈉溶液4.0 mL，避光條件下反應(yīng)1 h，以水為參比，于765 nm測定吸光值。分別以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）、吸光值（y）為橫、縱坐標(biāo)，線性回歸方程為y=0.0179x+0.114（R2=0.9995），多酚提取量計(jì)算公式如下。

式中：C為提取液中多酚的含量，mg/mL；V為提取液的體積，mL；M為玫瑰花粉末質(zhì)量，g；N為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 DES的篩選

1.3.3.1 DES的制備

DES的組成見表1。按照表1所示組分和摩爾比制備5種DES，將氫鍵受體與氫鍵供體按照一定摩爾比混合，置于磁力加熱攪拌器中，85℃恒溫?cái)嚢柚脸示弧⒊吻?、透明的液體[18]。

表1 DES的組成Table 1 Composition of the DES

1.3.3.2 DES的篩選

稱取 0.1 g 玫瑰花粉末，按料液比 1∶30（g/mL），分別加入30%含水量的DES，在超聲時(shí)間10 min、超聲功率300 W、超聲溫度30℃條件下提取玫瑰多酚。

1.3.4 兩種方法提取玫瑰多酚的條件優(yōu)化

分別用DES和乙醇作為提取劑提取玫瑰多酚，以多酚提取量為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察DES含水量（10%、20%、30%、40%、50%）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（10%、20%、30%、40%、50%）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]、超聲時(shí)間（5、10、15、20、25 min）、超聲功率（300、400、500、600、700 W）、超聲溫度（30、40、50、60、70℃）、提取次數(shù)（1、2、3、4次）對玫瑰多酚提取量的影響。

1.3.5 玫瑰多酚凍干粉制備流程

玫瑰多酚提取液→NKA-9大孔樹脂吸附→70%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇解吸附→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→冷凍干燥→多酚凍干粉。

1.3.6 玫瑰多酚凍干粉抗氧化活性的測定

1.3.6.1 總還原能力測定

參考Shon等[19]的方法并略作改動，稱取適量的玫瑰多酚凍干粉，用蒸餾水配制成 10、20、30、40、50 μg/mL的玫瑰多酚樣品溶液。分別將上述濃度梯度溶液1.0 mL與1%鐵氰化鉀溶液1.0 mL混合，50℃下反應(yīng)20 min后，加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL，渦旋均勻后，3 000 r/min離心10 min，將1 mL上清液、1 mL蒸餾水和0.2 mL的0.1%三氯化鐵溶液混勻，在700 nm處測定吸光值。以維生素C作為陽性對照。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力測定

參考Merghem等[20]的方法并略作改動，稱取適量玫瑰多酚凍干粉，用蒸餾水配制成 10、20、30、40、50 μg/mL的玫瑰多酚樣品溶液，分別將上述濃度梯度溶液1.0 mL與0.05 mg/mL的DPPH溶液1.0 mL混合，避光反應(yīng)20 min，分別測定無水乙醇代替樣品、樣品溶液、無水乙醇代替DPPH溶液在517 nm下的吸光度，記為A0、A1、A2，并以維生素C作為陽性對照，計(jì)算DPPH自由基的清除率，公式如下所示。

式中：A1為加入樣品后的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH溶液的吸光度；A0為無水乙醇代替樣品的吸光度。

1.3.6.3 ABTS+自由基清除能力測定

參考Binsan等[21]的方法并稍作修改，ABTS工作液的制備：將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，在室溫下避光過夜（12 h～16 h），制成ABTS+自由基儲備液備用。將儲備液用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處的吸光值為0.7±0.02，以此作為ABTS工作液。稱取適量的玫瑰多酚凍干粉，用蒸餾水配制成 10、20、30、40、50 μg/mL 的玫瑰多酚樣品溶液，分別將上述濃度梯度溶液0.1 mL與ABTS工作液1.0 mL混合，避光反應(yīng)6 min，分別測定無水乙醇代替樣品、樣品溶液在734 nm下的吸光值，記為A0、A1，并以維生素C作為陽性對照，計(jì)算ABTS+自由基的清除率，公式如下所示。

式中：A1為加入樣品的吸光度；A0為無水乙醇代替樣品的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析，每組試驗(yàn)樣品測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 DES的篩選

DES是由氫鍵受體和氫鍵供體組合而成的低共熔混合物，由于組成成分的不同，其對目標(biāo)提取物的提取效率不同。不同DES對玫瑰多酚提取量的影響見圖1。

圖1 不同DES對玫瑰多酚提取量的影響Fig.1 Effect of different DES on the extraction yield of rose polyphenols

由圖1可以看出，5種DES對玫瑰多酚的提取量大小順序依次為DES-1[（94.87±0.51 mg/g）]＞DES-2[（93.90±0.62 mg/g）]＞DES-5[（88.77±0.57 mg/g）]＞DES-3[（87.31±0.9 mg/g）]＞DES-4[（86.16±0.55 mg/g）]，其中DES-1對多酚的提取量最大。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上分析，DES-1與DES-2無顯著差異（P＞0.05），DES-1與 DES-3具有極顯著差異（P＜0.001），DES-1與DES-4和DES-5具有顯著差異（P＜0.01）。但是DES-2的黏度很大，不利于試驗(yàn)操作；DES-1的提取效果高于其他DES，可能是因?yàn)橄啾扔谄渌鸇ES，DES-1的黏度小，分散性好，能更好地與多酚分子接觸，且極性與多酚最相近。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇DES-1與乙醇進(jìn)行對比試驗(yàn)。

2.2 兩種方法提取玫瑰多酚的條件優(yōu)化

2.2.1 DES的含水量和乙醇體積分?jǐn)?shù)對玫瑰多酚提取量的影響

DES含水量對玫瑰多酚提取量的影響見圖2，乙醇體積分?jǐn)?shù)對玫瑰多酚提取量的影響見圖3。

圖2 DES含水量對玫瑰多酚提取量的影響Fig.2 Effect of water content in DES on the extraction yield of rose polyphenols

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對玫瑰多酚提取量的影響Fig.3 Effect of volume fraction of ethanol on the extraction yield of rose polyphenols

由圖2可知，隨著含水量的增加，多酚提取量先增加后減少。可能是由于在DES中加入適量水，可以增加DES分子流動性，降低黏度，增加擴(kuò)散能力[10]，使其能夠與多酚類化合物充分接觸，提高多酚提取效率，而當(dāng)DES含水量較高時(shí)，過量的水使溶液極性過大，DES與多酚間氫鍵作用力減弱，從而使玫瑰多酚提取量下降[22]。當(dāng)DES含水量為30%時(shí)，多酚提取量達(dá)到了最大值，為（94.86±0.25）mg/g。由圖 3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，玫瑰多酚的提取量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，可能是由于在一定范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增高有利于多酚類物質(zhì)的溶出，多酚提取量增加。當(dāng)超過該范圍后，由于溶出的較多雜質(zhì)多酚與競爭提取劑，導(dǎo)致多酚提取量降低。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大值，為（73.59±0.65）mg/g。因此選擇體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇與含水量30%的DES-1進(jìn)行后續(xù)的比較試驗(yàn)。

2.2.2 料液比對玫瑰多酚提取量的影響

圖4 料液比對玫瑰多酚提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of rose polyphenols

由圖4可知，當(dāng)料液比在一定范圍內(nèi)，多酚提取量隨溶劑量的上升而增大，可能是由于溶劑增多后，能更好地與原料相互作用，傳質(zhì)推動力提高，有利于增加多酚提取量[13]。當(dāng)原料中的多酚類物質(zhì)被全部提取出來后，繼續(xù)增加溶劑量，反而會使提取出來的多酚重新溶解到原料液中，使得多酚提取量下降，并且造成溶劑的浪費(fèi)。當(dāng)DES-1為提取劑，料液比 1∶40（g/mL）時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大值，為（113.74±0.55）mg/g；當(dāng)乙醇為提取劑，料液比1∶30（g/mL）時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大值，為（73.81±0.59）mg/g。因此，分別選擇DES提取劑料液比 1∶40（g/mL）和乙醇提取劑料液比 1∶30（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 超聲時(shí)間對玫瑰多酚提取量的影響

超聲時(shí)間對玫瑰多酚提取量的影響見圖5。

圖5 超聲時(shí)間對玫瑰多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of rose polyphenols

由圖5可知，隨著超聲時(shí)間延長，玫瑰多酚提取量呈先增大后減小的趨勢?？赡苁且?yàn)殡S著超聲時(shí)間增加，多酚逐漸溶出，使多酚提取量增加，但超聲時(shí)間繼續(xù)延長，可能會受光、熱等因素影響，導(dǎo)致部分提取出的玫瑰多酚被氧化，從而導(dǎo)致提取量的降低，并且超聲時(shí)間過長會增加能耗，增加提取成本[16]。當(dāng)分別以DES-1和乙醇為提取劑時(shí)，超聲時(shí)間都在10 min時(shí)，玫瑰多酚提取量達(dá)到最大，分別為（115.75±0.55）mg/g和（74.75±0.48）mg/g。

2.2.4 超聲功率對玫瑰多酚提取量的影響

超聲功率對玫瑰多酚提取量的影響見圖6。

圖6 超聲功率對玫瑰多酚提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of rose polyphenols

從圖6可知，隨著超聲功率的增大，玫瑰多酚提取量呈先增大后減小的趨勢。在超聲過程中，可能由于超聲波可以提供能量，將強(qiáng)烈的振動傳遞給玫瑰花粉末和溶劑，原料細(xì)胞部分被破壞，加快胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，并且強(qiáng)化了溶質(zhì)擴(kuò)散，因而提取量增加[23]。而當(dāng)超聲功率繼續(xù)增大時(shí)，可能引起部分多酚的降解，從而使多酚提取量下降。當(dāng)分別以DES-1和乙醇為提取劑，超聲功率都在400 W時(shí)，玫瑰多酚提取量達(dá)到最大，分別為（117.54±0.54）mg/g和（76.37±0.45）mg/g。

2.2.5 超聲溫度對玫瑰多酚提取量的影響

腦癱是一種致殘性慢性病，除了醫(yī)療康復(fù)外，需要長期、有效的家庭康復(fù)保駕護(hù)航，才能保證兒童康復(fù)的療效，讓更多兒童回歸家庭和社會。把醫(yī)院的醫(yī)療康復(fù)延續(xù)到家里，這更符合目前我國的基本國情。已有大量研究表明家庭康復(fù)在腦癱患兒的康復(fù)訓(xùn)練中有顯著重要性，醫(yī)院加家庭康復(fù)訓(xùn)練的強(qiáng)化訓(xùn)練模式是兒童腦癱康復(fù)行之有效的方法[11-13],堅(jiān)持家庭康復(fù)的腦癱患兒療效比不堅(jiān)持家庭康復(fù)的更好。父母的心理狀況不良，將會影響家庭康復(fù)的執(zhí)行，進(jìn)而影響腦癱兒童康復(fù)療效。對腦癱患兒父母進(jìn)行心理干預(yù)可以更好地提高患兒康復(fù)療效[14]。關(guān)注腦癱患兒父母的心理狀況及影響因素，出臺救助政策、完善社會服務(wù)支持、積極開展家長工作等有深遠(yuǎn)意義。

超聲溫度對玫瑰多酚提取量的影響見圖7。

圖7 超聲溫度對玫瑰多酚提取量的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of rose polyphenols

由圖7可知，隨著超聲溫度的升高，玫瑰多酚提取量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。隨著溫度的升高，分子運(yùn)動加劇，提高了多酚類化合物在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)和溶解度[24]，使得多酚提取量增加。而當(dāng)超聲溫度繼續(xù)升高時(shí)，可能導(dǎo)致部分熱敏性的多酚被降解，使得多酚提取量減少。當(dāng)分別以DES-1和乙醇為提取劑，超聲溫度都在50℃時(shí)，玫瑰多酚提取量達(dá)到最大，分別為（120.89±0.48）mg/g 和（78.94±0.52）mg/g。

2.2.6 提取次數(shù)對玫瑰多酚提取量的影響

提取次數(shù)對玫瑰多酚提取量的影響見圖8。

圖8 提取次數(shù)對玫瑰多酚提取量的影響Fig.8 Effect of extraction times on the extraction yield of rose polyphenols

由圖8可知，隨著提取次數(shù)的增加，玫瑰多酚的提取總量逐漸上升，以DES-1為提取劑和以乙醇為提取劑的趨勢相同，而當(dāng)繼續(xù)增加提取次數(shù)時(shí)，提取次數(shù)對玫瑰多酚提取量的提高不明顯。因此，選擇提取次數(shù)為2次，在提取量合理的情況下，降低了提取成本。

2.3 兩種玫瑰多酚提取方法的比較

在DES-1與乙醇對多酚提取最優(yōu)的條件下，將兩種方法所得的玫瑰多酚提取量進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

表2 兩種玫瑰多酚提取方法的比較Table 2 Comparison of two extraction methods of rose polyphenols

與乙醇提取法相比，DES法的玫瑰多酚提取量提高了24%，這可能是由于DES與多酚類化合物之間有較強(qiáng)的氫鍵作用力，其擴(kuò)散力、溶解度和極性有利于多酚類化合物的溶出[25]。因此，對于玫瑰多酚的提取，DES法較傳統(tǒng)乙醇提取法效果更好。在后續(xù)的抗氧化試驗(yàn)中，使用DES法提取的玫瑰多酚進(jìn)行測定。

2.4 玫瑰多酚抗氧化活性的測定

2.4.1 總還原能力

還原能力可延緩或終止自由基反應(yīng)，可以通過還原能力的測定來評價(jià)樣品的抗氧化活性。總還原能力測定結(jié)果見圖9。

圖9 玫瑰多酚的總還原能力Fig.9 Total reducing power of rose polyphenols

由圖9可見，隨著樣品質(zhì)量濃度增大，玫瑰多酚和維生素C吸光度逐漸增大，還原能力增強(qiáng)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)玫瑰多酚和維生素C在10 μg/mL～50 μg/mL時(shí)，還原能力均隨著濃度的增加呈線性增加，而在10 μg/mL～20 μg/mL，玫瑰多酚和維生素 C 的還原能力相差較小。

2.4.2 玫瑰多酚DPPH自由基清除能力

玫瑰多酚DPPH自由基的清除能力見圖10。

圖10 玫瑰多酚DPPH自由基的清除能力Fig.10 The DPPH free radicals scavenging ability of rose polyphenols

由圖 10 可見，在 10 μg/mL～30 μg/mL，隨著多酚質(zhì)量濃度的增加，其對DPPH自由基清除能力逐漸上升，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度在30 μg/mL時(shí)，其對DPPH自由基的清除率已達(dá)到95.24%，隨后繼續(xù)增加多酚濃度對DPPH自由基清除效果沒有太大的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示，高質(zhì)量濃度的玫瑰多酚擁有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。從20 μg/mL～50 μg/mL來看，玫瑰多酚與維生素C的DPPH自由基清除能力相當(dāng)。

2.4.3 ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除能力見圖11。

圖11 玫瑰多酚ABTS+自由基清除能力Fig.11 ABTS+free radical scavenging ability of rose polyphenol

由圖11可見，隨著樣品質(zhì)量濃度增大，玫瑰多酚和維生素C的ABTS+自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)玫瑰多酚與維生素C的ABTS+自由基清除率均接近100%時(shí)，玫瑰多酚濃度為40 μg/mL，而維生素C的濃度為50 μg/mL。因此，由試驗(yàn)結(jié)果所示，玫瑰多酚清除ABTS+自由基能力優(yōu)于維生素C。

3 結(jié)論

本研究以盛產(chǎn)于河北省衡水市的重瓣玫瑰“豐花1號”為原料，采用超聲輔助DES法對玫瑰花中的多酚進(jìn)行高效快速提取，并與傳統(tǒng)乙醇提取方法進(jìn)行比較。通過優(yōu)化單因素試驗(yàn)得到的DES法提取玫瑰多酚的最佳工藝條件：含水量30%的氯化膽堿-乳酸（摩爾比 1∶2）為最佳提取劑，料液比 1∶40（g/mL）、超聲時(shí)間10 min、超聲功率400 W、超聲溫度50℃、提取2次，所得多酚提取量為（136.20±1.23）mg/g。與乙醇提取法相比，DES法的多酚提取量提高了24%。表明超聲輔助DES法是一種高效環(huán)保的玫瑰多酚提取方法。對純化后的多酚進(jìn)行體外抗氧化活性的測定，表明其具有良好的還原能力、DPPH自由基清除能力以及ABTS+自由基清除能力，具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。本研究為玫瑰多酚等活性物質(zhì)的綠色提取提供了新思路，為其在天然抗氧化劑中的應(yīng)用中提供了科學(xué)依據(jù)。