吳金松，耿廣威，任聰，徐軍，楊新玲，丁德剛

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院理學(xué)部，河南 鄭州 450046）

山藥是薯蕷的干燥塊根，既可以用作藥材，也可以直接食用，主要產(chǎn)于河南焦作、溫縣，山西太谷、介體，河北安國、保安，陜西大荔、渭南、漢中等地[1]。最初記載于《神農(nóng)草本經(jīng)》，山藥的營養(yǎng)成分主要有淀粉、維生素、粗纖維、糖蛋白、脂肪、礦物質(zhì)等，還具有多糖、黃酮、尿素囊等活性成分。山藥具有抗氧化、祛濕氣、滋養(yǎng)脾肺、養(yǎng)胃等功效，可用于食欲不振、脾胃虛弱、腹瀉、高血糖等癥[2-4]，具有良好的作用。目前市場上不斷涌現(xiàn)出各種各樣以山藥為原料制成的食品及零食，如山藥粉、山藥薯片等，這些產(chǎn)品在加工削皮過程中，產(chǎn)生約20%的副產(chǎn)物，其中大量副產(chǎn)物被視為垃圾直接丟棄，不僅造成了資源浪費而且還會污染環(huán)境，因此如何將山藥皮再利用具有重要的科研價值。

山藥皮成分與山藥肉基本一致，富含皂苷、多酚、多糖、黃酮、糖蛋白和粗纖維等營養(yǎng)成分[5-10]。山藥多糖具有抗氧化、降低血糖、解酒等功效，其在食品加工和生物材料領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[11-14]。周慶峰等[15]建造小鼠急性酒精中毒模型，通過觀察給藥后醉酒小鼠入睡潛伏期和醉酒時間，以及血清和肝組織中反應(yīng)肝功能的生化指標(biāo)變化，探究山藥多糖的解酒護肝作用，為研制解酒藥物新品種作參考。然而，國內(nèi)外對于山藥皮水溶性多糖的分離提取工藝研究報道較少，相較于傳統(tǒng)多糖提取工藝方法的水煮醇沉法、酸堿水解法、酶輔助法、超聲輔助法和微波輔助法等[16-19]，超聲輔助酶法利用超聲破壞細(xì)胞，結(jié)合酶水解作用，使多糖成分?jǐn)U散釋放，提高提取效率。為提高山藥皮的利用價值，本研究主要通過單因素和正交試驗，優(yōu)化超聲結(jié)合酶法提取山藥皮中水溶性多糖的提取工藝，以期為山藥皮的綜合開發(fā)以及在食品添加劑中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鐵棍山藥：河南溫縣。

無水乙醇（分析純）：河南新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司；葡萄糖標(biāo)品、苯酚、溴化鉀（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸（分析純）：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純）：開封市盛源化工有限公司，以上試劑均為分析純；果膠酶（食品級，≥100 000 U/g）：上海士鋒生物科技有限公司；中性蛋白酶（食品級，≥100 000 U/g）、纖維素酶（食品級，≥100 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA3204B型分析天平（感量0.000 1 g）：上海佑科儀器儀表有限公司；BJ-150型多功能粉碎機：德清拜杰電器有限公司；Hanon i2型可見光分光光度計：濟南海能儀器股份有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；is10型中紅外傅里葉變換紅外光譜儀：美國尼高力公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗流程

新鮮的鐵棍山藥→去皮、榨汁→收集山藥皮→烘干→粉碎→過篩（50目）→得到山藥皮粉→準(zhǔn)確稱取3.000 g山藥皮粉→調(diào)節(jié)酶解pH值→酶解-超聲→抽濾→稀釋濾液→測量吸光值→計算粗多糖提取率→濾液濃縮→醇沉→抽濾→干燥→紫外吸收掃描→紅外光譜測定。

1）把新鮮的鐵棍山藥去皮保留干凈的山藥皮，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中，調(diào)節(jié)溫度為60℃，烘干6 h～8 h，將山藥皮取出來，把干燥后的山藥皮放進粉碎機粉碎成粉末，將粉碎后的山藥皮粉過篩（50目），將得到的山藥皮粉放入密封袋中備用。

2）準(zhǔn)確稱取3.000 g山藥皮粉，配制一定的料液比（山藥皮粉和蒸餾水比例），通過pH計對溶液進行酶解pH值的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)pH值所用的緩沖溶液為1∶50（體積比）的乙酸分析純稀釋液，調(diào)節(jié)到所需的酶解pH值。調(diào)好pH值后，加入一定比例的酶，進行充分?jǐn)嚢琛?/p>

3）將溶液按照不同參數(shù)條件進行超聲處理。

4）將酶解-超聲后的溶液進行抽濾，收集濾液。

5）將得到的濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進行抽濾，調(diào)制旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀參數(shù)為溫度60℃，轉(zhuǎn)速70 r/min，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL～20 mL。

6）將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的濾液，按照1∶5的體積比加入95%乙醇，將混勻的溶液放置在4℃的冰箱中靜置醇沉12 h。

7）將醇沉后的溶液進行抽濾，將得到的粗多糖放入鼓風(fēng)干燥箱中進行干燥，設(shè)置參數(shù)為溫度60℃，干燥4 h，得到干燥后的粗多糖。

1.3.2 超聲輔助酶法提取山藥皮粗多糖的單因素試驗

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[20-23]得到影響植物多糖提取的主要因素有輔助酶的種類、加酶量（%）、酶解pH值、料液比（g/mL）、酶解-超聲時間（min）、酶解-超聲溫度（℃）、超聲功率（W），本研究選擇以上單因素進行試驗。具體單因素提取條件∶山藥皮粉 3.000 g，按 1∶30（g/mL）料液比加入蒸餾水，醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0，分別加入4.0%3種酶，設(shè)置超聲功率300 W，酶解-超聲溫度50℃，酶解-超聲時間40 min為基準(zhǔn)，變換各單因素水平，進行酶解-超聲輔助提取，并測定山藥皮粗多糖提取率，每組平行測定3次。

1.3.3 超聲輔助酶法提取山藥皮粗多糖的正交試驗優(yōu)化

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，選定纖維素酶為輔助提取酶，酶解pH值為5.0，酶解-超聲溫度為55℃，選取料液比（g/mL）、加酶量（%）、酶解-超聲時間（min）、超聲功率（W）4個因素，以山藥皮粗多糖提取率為指標(biāo)，設(shè)計四因素三水平L9（34）的正交試驗，優(yōu)化超聲結(jié)合酶法輔助提取鐵棍山藥皮多糖的工藝。因素選取及水平安排見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Levels of factors in orthogonal experiment

1.3.4 山藥皮粗多糖提取率的測定

1.3.4.1 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用硫酸-苯酚法[24]繪制葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取0.100 0 g無水葡萄糖，用蒸餾水將其溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5.0 mL的移液管吸取5.0 mL 1.0 mg/mL的葡萄糖溶液放入50 mL的容量瓶中，配制成0.1 mg/mL的葡萄糖溶液，以備后續(xù)試驗使用。用移液管分別吸取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 0.1mg/mL 的葡萄糖溶液放入對應(yīng)試管中，再用移液管分別吸取1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL的蒸餾水使其總體積為1.0 mL，再用移液管吸取1.0 mL配制好的5%的苯酚溶液，移液管吸取5.0 mL的硫酸，立即振蕩均勻，靜置30 min，設(shè)置可見光分光光度計490 nm的波長，測量吸光值，根據(jù)每組測出的吸光值繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y=0.010 5x+0.000 8，相關(guān)系數(shù) R2=0.998 6。

1.3.4.2 超聲輔助酶法提取山藥皮粗多糖提取率的測定

根據(jù)測量溶液的吸光值，計算出粗多糖濃度，再根據(jù)以下公式[25]計算粗多糖的提取率。

式中：C為從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算得到的濃度，μg/mL；V為過濾后的濾液體積，mL；D為取一定濾液稀釋的倍數(shù)；m為稱取山藥皮的質(zhì)量，g。

1.3.5 山藥皮粗多糖的紫外全波段掃描

稱取最優(yōu)試驗方案提取的山藥皮粗多糖0.5000g，加入蒸餾水，定容于100 mL容量瓶，配制成5 mg/mL溶液，設(shè)置波長范圍為190 nm～400 nm，通過雙光束紫外可見分光光度計測量吸收峰，觀察圖譜[26]。

1.3.6 山藥皮粗多糖的紅外光譜測定

稱取最優(yōu)試驗方案提取的山藥皮粗多糖0.010 0 g，放在表面皿上放入紅外干燥箱中，干燥后將其放在研缽中，按質(zhì)量比1∶100加入溴化鉀晶體進行研磨。將研磨后的粉末進行壓片，傅里葉變換紅外光譜儀測量官能團的伸縮振動峰[27]。

1.4 試驗數(shù)據(jù)分析方法

利用Origin 8.6和Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行制圖，采用正交表對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對山藥皮多糖提取率的影響

2.1.1 不同輔助酶對山藥皮粗多糖提取率的影響

不同種類酶對山藥皮粗多糖提取率的影響見圖1。

圖1 酶種類對山藥皮粗多糖提取率的影響Fig.1 Extraction rate of crude polysaccharide from peel of Rhizoma dioscoreae with different enzymes

由圖1可知，添加纖維素酶的山藥皮樣品粗多糖提取率為9.26%，添加果膠酶的山藥皮樣品粗多糖提取率為7.35%，添加中性蛋白酶的山藥皮樣品粗多糖提取率為7.43%。由于山藥皮中含有較多的粗纖維，因此使用纖維素酶作為輔助酶提取粗多糖時，提取率明顯高于果膠酶和中性蛋白酶，故本試驗采用纖維素酶作為輔助酶提取山藥皮粗多糖。

2.1.2 料液比對山藥皮粗多糖提取率的影響

料液比對山藥皮粗多糖提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對山藥皮粗多糖提取率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of crude polysaccharide from peel of Rhizoma dioscoreae

由圖2可知，山藥皮粗多糖提取率隨溶劑添加量增加，呈現(xiàn)先增后減的趨勢。溶劑添加量較低，樣品稠度過大，多糖浸提不完全，因而提取率較低，隨著溶液中水分的增加，粗多糖提取率也逐漸增大，至料液比為1∶40（g/mL）時，粗多糖幾乎被完全浸提，提取率可達(dá)10.30%，溶劑添加量增加，無利于提取率的提高[28]。因此選擇料液比 1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）進行正交試驗。

2.1.3 加酶量對山藥皮粗多糖提取率的影響

加酶量對山藥皮粗多糖提取率的影響見圖3。

圖3 不同加酶量對山藥皮粗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on the extraction rate of crude polysaccharide from peel of Rhizoma dioscoreae

由圖3可知，隨著加酶量的增大，山藥皮粗多糖提取率也隨之增大，呈不斷增加趨勢，加酶量為5.0%時，粗多糖提取率最高，達(dá)到10.40%。其原因是在加酶量較低時，溶液中酶含量過少，不能與樣品充分接觸，隨著加酶量的增大，酶與樣品充分接觸，提取率逐漸上升[29]，考慮到加酶量過高會增加后續(xù)純化的難度，因此正交試驗選取加酶量4.0%、4.5%、5.0%3個水平。

2.1.4 超聲功率對山藥皮粗多糖提取率的影響

超聲功率對山藥皮粗多糖提取率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對山藥皮粗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of crude polysaccharide from peel of Rhizoma dioscoreae

由圖4可知，山藥皮粗多糖提取率隨超聲功率的增大呈先增大后減小的趨勢，超聲功率為350 W時，山藥皮粗多糖提取效果最佳，可達(dá)9.69%。出現(xiàn)此現(xiàn)象可能是因為超聲功率過低時，山藥皮中的活性成分結(jié)構(gòu)不能被破壞，導(dǎo)致提取率較低，當(dāng)提取率達(dá)到最大后，細(xì)胞被完全破壞，粗多糖已被全部提出，繼續(xù)增加超聲功率，超聲對提取出的粗多糖也會產(chǎn)生影響，提取率反而降低[28]，因此進行正交試驗所選取的超聲功率的水平為300、350、400 W。

2.1.5 酶解-超聲時間對山藥皮粗多糖提取率的影響

酶解-超聲時間對山藥皮粗多糖提取率的影響見圖5。

圖5 酶解-超聲時間對山藥皮粗多糖提取率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis-sonication duration on the extraction rate of crude polysaccharide from peel of Rhizoma dioscoreae

由圖5可知，隨著酶解-超聲時間的延長，山藥皮粗多糖提取率呈上升趨勢，60 min時，粗多糖提取率最高為9.85%。當(dāng)時間較短時，酶解超聲對樣品作用時間過短，因此提取率較低，隨著時間的延長，樣品被充分溶解破壞，提取率逐漸增大，作用50 min和60 min對提取率增加的影響較大，更容易控制，因此正交試驗選取的酶解-超聲時間水平為40、50、60 min。

2.1.6 酶解pH值對山藥皮粗多糖提取率的影響

酶解pH值對山藥皮粗多糖提取率的影響見圖6。

圖6 酶解pH值對山藥皮粗多糖提取率的影響Fig.6 Effect of pH for enzymolysis on extraction rate of crude polysaccharide from peel of Rhizoma dioscoreae

由圖6可知，山藥皮粗多糖提取率隨pH值的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在pH值為5.0時提取率最大，達(dá)10.05%。在pH值較小時，酸性纖維素酶活性低，反應(yīng)緩慢，隨著pH值的增大，當(dāng)pH值為5.0時，酸性纖維素酶活性達(dá)到最大，分子運動加快，此時發(fā)揮作用最大，粗多糖提取率最高，繼續(xù)增大pH值，酶活力下降，影響山藥皮粗多糖的提取[29]。pH值由5.0到5.2時，提取率減少，因此，固定pH值為5.0進行正交試驗。

2.1.7 酶解-超聲溫度對山藥皮粗多糖提取率的影響

酶解-超聲溫度對山藥皮粗多糖提取率的影響見圖7。

圖7 酶解-超聲溫度對山藥皮粗多糖提取率的影響Fig.7 Effect of temperature for enzymolysis-ultrasonic on the extraction rate of crude polysaccharide from peel of Rhizoma dioscoreae

由圖7可知，隨著酶解-超聲溫度的增大，山藥皮粗多糖提取率先增后減，酶解-超聲溫度為55℃時，粗多糖提取率最高，達(dá)到9.86%。原因是在溫度較低時，酶和超聲波均不能完全發(fā)揮作用，提取率較低，隨著溫度的增加，酶和超聲同時發(fā)揮更大作用，提取率也隨之增加。溫度上升至55℃時，酶的活性最高，因此提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加溫度，酶活性反而降低，提取率也降低。酶解-超聲溫度從45℃上升至60℃，需消耗大量時間，根據(jù)圖7粗多糖提取率基本維持在9.7%左右可知，酶解-超聲溫度對山藥皮粗多糖影響較小，因此為節(jié)約成本正交試驗時溫度設(shè)置為55℃。

2.2 正交試驗結(jié)合方差分析結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結(jié)果及極差分析Table 2 Result of orthogonal experiment and range analysis

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由自由度分布查臨界值可得，F(xiàn)0.05（2，9）=4.26，F(xiàn)0.01（2，9）=8.02，所以因素A、B、C、D對試驗結(jié)果影響顯著。結(jié)合極差分析和方差分析可知，影響山藥皮粗多糖提取率的因素主次順序為B＞D＞C＞A，即加酶量＞超聲功率＞酶解-超聲時間＞料液比。不考慮交互作用，根據(jù)表2中K值可得，山藥皮粗多糖提取最優(yōu)方案為A3B3C3D2，即加酶量5.0%、超聲功率350 W、酶解-超聲時間 60 min，料液比 1∶50（g/mL）。以此條件做驗證試驗，山藥皮粗多糖提取率分別為10.98%、10.95%、11.00%，平均提取率為10.98%。

2.3 山藥皮粗多糖紫外吸收曲線

山藥皮粗多糖紫外吸收曲線見圖8。

圖8 山藥皮粗多糖紫外吸收曲線Fig.8 Ultraviolet spectrum of crude polysaccharide from peel of Rhizoma dioscoreae

粗多糖中蛋白或核酸含量較高時，會在260 nm～280 nm出現(xiàn)吸收峰[26]，由圖8可知，山藥皮粗多糖在260 nm～280 nm處沒有吸收峰，說明山藥皮粗多糖含極少量或不含有蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)，提取效果較好。

2.4 山藥皮粗多糖紅外光譜

山藥皮粗多糖紅外光譜見圖9。

圖9 山藥皮粗多糖紅外光譜Fig.9 Infrared spectrum of crude polysaccharide from peel of Rhizoma dioscoreae

通過文獻(xiàn)[27]可知，對糖類進行紅外掃描，不同類型基團振動會產(chǎn)生不同波峰，3 416.92 cm-1對應(yīng)的是O-H和N-H的伸縮振動，2 921.66 cm-1、2 850.73 cm-1對應(yīng)的C-H伸縮振動，1 643.77 cm-1對應(yīng)的是雙鍵的伸縮振動，由圖9山藥皮粗多糖紅外光譜及分析可知，用超聲結(jié)合酶法輔助提取的山藥皮粗多糖符合多糖基本特征。

3 結(jié)論

以鐵棍山藥皮粉末為樣品，采用超聲結(jié)合酶法提取山藥皮粗多糖。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定酶解pH值為5.0，酶解-超聲溫度為55℃，選取料液比、加酶量、酶解-超聲時間、超聲功率4個因素做正交試驗，在不考慮交互作用的情況下，得到最佳提取方案為加酶量5.0%、超聲功率350 W、酶解-超聲時間60 min，料液比1∶50（g/mL），再通過驗證試驗粗多糖提取率為10.98%。結(jié)合紫外和紅外分析可知，鐵棍山藥皮粗多糖中不含或含有極少量雜質(zhì)，符合多糖基本特征。因此用超聲結(jié)合酶法輔助提取鐵棍山藥皮多糖具有操作簡便，提取效率高且雜質(zhì)少等優(yōu)點，本研究為山藥皮的綜合開發(fā)及其在食品功能因子的應(yīng)用提供參考。