李達(dá)，劉鵬，紀(jì)海玉，賈曉昱，田凌

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，生物工程學(xué)院，天津 300451；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所，天津 300384；4.唐山市盛川農(nóng)產(chǎn)品股份有限公司，河北 唐山 064105）

坦洋工夫紅茶是福建著名的全發(fā)酵茶品，以芽葉為原料，經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等傳統(tǒng)的制茶工藝制作而成[1]，其富含兒茶素、茶黃素和茶紅素等多種抗氧化多酚物質(zhì)及具有生物活性的碳水化合物等[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體的衰老主要由氧化損傷導(dǎo)致，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)能力下降、記憶力衰退等明顯特征[4]。紅茶多糖是來源于紅茶的一種重要功能性碳水化合物，因其良好的水溶性而更容易被機(jī)體消化吸收[5]。研究表明紅茶多糖具有良好的抗氧化活性[6-9]，但目前關(guān)于其生物活性的研究較少。大量的抗衰老研究中建立了D-半乳糖致衰老小鼠模型[10-12]，本實(shí)驗(yàn)也利用D-半乳糖對小鼠進(jìn)行造模，并觀察記錄模型小鼠的行為學(xué)變化，從而研究坦洋工夫紅茶多糖對造模小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶多糖：坦洋工夫紅茶多糖為天津科技大學(xué)功能食品實(shí)驗(yàn)室抽提干燥制備，提取劑為75%乙醇溶液、液料比 30∶1（mL/g）、提取溫度 60 ℃、提取時(shí)間 70 min，3 500 Da透析袋透析，-80℃冷凍干燥。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ICR 小鼠40只，雄性，體質(zhì)量（28±2）g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部[SCXK（京）2011-0012]。

D-半乳糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸：上海阿拉丁生化科技有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性檢測試劑盒及丙二醛含量（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Morris水迷宮：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；高速冷凍離心機(jī)（5804r）：德國艾本德股份公司；紫外分光光度計(jì)（T6新世紀(jì)）：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 D-半乳糖致衰老模型的建立

將40只小鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白對照組[灌胃10 mL/（kg·d）生理鹽水]、模型對照組[灌胃10 mL/（kg·d）生理鹽水]、紅茶多糖低劑量組[500 mg/（kg·d）]、紅茶多糖高劑量組[1 000 mg/（kg·d）]，每組10只。除空白對照組外，每日皮下注射D-半乳糖溶液（125 mg/kg），空白對照組注射等劑量無菌生理鹽水。連續(xù)注射和灌胃6周，每周稱重。

1.3.2 行為學(xué)評價(jià)

1.3.2.1 水迷宮測試

給藥后5周進(jìn)行Morris水迷宮測試，訓(xùn)練期間照常給藥及進(jìn)食。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程分為隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)兩部分[13-15]。

1.3.2.2 曠場實(shí)驗(yàn)測試

將小鼠置于曠場實(shí)驗(yàn)箱2進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)測試，每只觀察5 min，用紅外攝像系統(tǒng)記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，包括，中央格停留時(shí)間：即小鼠被放入開闊箱中央格至其三爪跨離該格的時(shí)間；直立次數(shù)：兩前爪騰空1 cm以上或攀附墻壁次數(shù)；移動(dòng)路程:計(jì)算5 min內(nèi)大鼠的移動(dòng)路程；平均速度:計(jì)算大鼠在移動(dòng)過程中的平均速度；糞便粒數(shù)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，遺留在箱底的糞便數(shù)（每只小鼠實(shí)驗(yàn)完畢取出后，及時(shí)清理其排泄物，將開闊箱打掃干凈，以免留有氣味而干擾下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)）[16-18]。

1.3.2.3 小鼠主要臟器指數(shù)及血清抗氧化能力測定

造模6周后，在最末次給藥后，禁食12 h。小鼠頸椎脫臼處死，解剖取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及腦組織，稱取重量記錄臟器指數(shù)（以g/100 g計(jì)），稱重完畢后制備10%組織勻漿，4℃條件下，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定組織中CAT含量及TAOC、MDA、SOD以及GSH-Px活性。

1.3.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS21.0軟件，進(jìn)行單因素方差分析，組間采用t檢驗(yàn)，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

記憶力的衰退是衰老的重要生理特征之一，本文采用經(jīng)典行為學(xué)測試方法水迷宮實(shí)驗(yàn)[19]，分別在實(shí)驗(yàn)初始階段進(jìn)行隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn)篩選小鼠，在給藥5周后進(jìn)行4 d的訓(xùn)練（隱藏平臺尋找實(shí)驗(yàn)）及一個(gè)測試階段（空間搜索實(shí)驗(yàn)），根據(jù)小鼠測試成績對其體現(xiàn)在記憶能力方面的衰老程度進(jìn)行評價(jià)，用以分析探討坦洋工夫紅茶多糖對該模型小鼠衰老程度的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 紅茶多糖對小鼠4天內(nèi)水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響Fig.1 Effect of TBTP on escape latency in 4 days of water maze

由圖1可以看出，經(jīng)過4 d的訓(xùn)練，各組小鼠在第3、4天獲取平臺時(shí)間基本穩(wěn)定，說明各組小鼠已經(jīng)基本學(xué)會尋找目標(biāo)平臺。模型對照組獲取平臺時(shí)間顯高于其他3組，說明D-半乳糖造模使小鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力都出現(xiàn)了明顯的下降，在第4天，空白對照組和紅茶多糖高劑量組小鼠都表現(xiàn)出了較好的記憶能力，且兩組成績未呈現(xiàn)明顯差異，均優(yōu)于紅茶多糖低劑量組，說明TBTP的抗衰老作用表現(xiàn)出了劑量依賴趨勢。

測試階段的空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 紅茶多糖對小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)空間搜索的影響Table 1 Effect of TBTP on water maze performance in aging mice

如表1所示，與空白對照組相比，模型對照組小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間及穿越平臺次數(shù)均有顯著降低，不同劑量TBTP小鼠測試成績均高于模型對照組，且紅茶多糖高劑量組兩項(xiàng)測試結(jié)果均顯著高于模型對照組，并與空白對照組未呈現(xiàn)顯著性差異。由此可見，TBTP可以減輕D-半乳糖造成的記憶力減退，甚至增強(qiáng)小鼠的空間記憶能力，且其效果呈現(xiàn)劑量型依賴。

2.2 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果

曠場實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚝饬啃∈蟮男袨閷W(xué)能力[20-22]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 紅茶多糖對小鼠曠場實(shí)驗(yàn)的影響Table 2 Effect of TBTP on open-field test in aging mice

與空白對照組比，模型對照組衰老小鼠的移動(dòng)距離、平均移動(dòng)速度以及直立次數(shù)均表現(xiàn)出顯著的降低，而停留時(shí)間則顯著增加，糞便粒數(shù)減少；與模型對照組比，不同劑量TBTP小鼠的曠場實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均優(yōu)于模型對照組，與紅茶多糖低劑量組相比高劑量組小鼠在移動(dòng)距離長度有所增加。由此可見，綜合上述兩項(xiàng)結(jié)果，從行為學(xué)角度出發(fā)，TBTP可以延緩衰老進(jìn)程，且本實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)出了劑量依賴關(guān)系。

2.3 TBTP對小鼠主要臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)可以反映造模劑及實(shí)驗(yàn)用藥對機(jī)體的影響，ICR小鼠的臟器指數(shù)如表3所示。

表3 紅茶多糖對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of TBTP on organ index in aging mice g/100 g

由表3可知，D-半乳糖的相對長期（6周）作用，導(dǎo)致小鼠肝、腎指數(shù)的顯著降低，使肝、腎這兩個(gè)主要參與代謝的臟器發(fā)生萎縮的現(xiàn)象，而灌胃TBTP可以在一定程度上抑制或緩解這一現(xiàn)象。而本模型小鼠的其他主要臟器，包括心、脾、肺和腦在質(zhì)量上無明顯變化，TBTP亦不對其產(chǎn)生影響。

2.4 TBTP對小鼠體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的影響

2.4.1 TBTP對小鼠血清的抗氧化系統(tǒng)的影響

致衰老物質(zhì)能夠影響血清中的各項(xiàng)指標(biāo)，從而使機(jī)體能力衰退。TBTP對小鼠血清抗氧化系統(tǒng)的主要影響如表4所示。

表4 紅茶多糖對小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effect of TBTP on serum antioxidant system indicators in aging mice

TAOC、SOD、CAT、GSH-Px 活力越高則血清抗氧化能力越強(qiáng)。D-半乳糖造模小鼠的血清指標(biāo)均明顯低于空白對照組，不同劑量TBTP小鼠的測試結(jié)果均高于模型對照組，紅茶多糖高劑量組與模型對照組相比各項(xiàng)指標(biāo)均出現(xiàn)了顯著性提升，并且，TAOC和GSHPx指標(biāo)與空白對照組相比的均有顯著提升。結(jié)果表明，TBTP能夠提升小鼠血清的抗氧化水平且呈現(xiàn)明顯的劑量型關(guān)系。

2.4.2 TBTP對小鼠腦組織的抗氧化系統(tǒng)的影響

腦組織中的抗氧化酶種類豐富，TBTP對小鼠腦組織抗氧化系統(tǒng)的影響如表5所示。

表5 紅茶多糖對小鼠腦組織抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effect of TBTP on brain antioxidant system indicators in aging mice

TAOC、SOD、GSH-Px活力越高則腦組織的抗氧化能力越強(qiáng)。而過度氧化則會使腦組織中的MDA含量增加。D-半乳糖造模小鼠的TAOC、SOD、GSH-Px均明顯低于空白對照組，不同劑量TBTP小鼠的測試結(jié)果均優(yōu)于模型對照組，兩組紅茶多糖與模型對照組相比除MDA活性外各項(xiàng)指標(biāo)均出現(xiàn)了顯著性提升，且紅茶多糖高劑量組指標(biāo)更優(yōu)，但是在腦組織中空白對照組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其余3組，說明TBTP對于腦組織的抗氧化效果低于血清。

3 結(jié)論

研究表明，與模型對照組相比，水迷宮實(shí)驗(yàn)搜臺潛伏期顯著縮短（P＜0.01），空間探索能力明顯增強(qiáng)（P＜0.01），曠場實(shí)驗(yàn)移動(dòng)路程長度和直立次數(shù)顯著增加（P＜0.01），TBTP顯著的改善了衰老小鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力。并且，TBTP有效提升了衰老模型小鼠的肝、腎指數(shù)，以及提升了血清及腦組織的TAOC、SOD、CAT和GSH-Px活力，并降低了MDA含量，甚至在血清中的TAOC及GSH-Px活力優(yōu)于空白對照組小鼠。綜合表明TBTP有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠有效提升機(jī)體的抗氧化能力。