王小娟，任 莉，張鈴玉，李潔明，周 波，王惠民,4，蘇文金，吳達(dá)仁

(1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018；4.臺灣中興大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所，臺灣 臺中 402)

0 引言

黃瓜(CucumissativusL.)在世界各地都有種植[1]。除碳水化合物和膳食纖維外，黃瓜中還含有豐富的維生素和礦物質(zhì)，具有清熱解毒、健腦安神等功效[2]。近年來，黃瓜的種植面積以及集約化種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，而常年的黃瓜連作種植也導(dǎo)致了土傳枯萎病害的泛濫[3]。黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜專化型病原真菌引起的一種危害性極強(qiáng)的世界性土傳病害[4]，黃瓜的整個生長期都有可能感染尖孢鐮刀菌。由于尖孢鐮刀菌的生命力極強(qiáng)，可存活于土壤長達(dá)10 a以上，并隨著作物種植時間的增長不斷累積，這也導(dǎo)致黃瓜枯萎病成為黃瓜種植過程中難以防治的病害之一。有研究表明，當(dāng)黃瓜枯萎病嚴(yán)重時，黃瓜減產(chǎn)率高達(dá)50%以上甚至絕產(chǎn)，更嚴(yán)重時，就會導(dǎo)致致病土壤不適宜黃瓜栽種[3]，給世界各國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

目前，黃瓜枯萎病的防治手段主要為化學(xué)防治、物理防治和生物防治等[6]。這些防治方法對黃瓜枯萎病都具有一定的防治效果，但是每種方法各有優(yōu)劣。使用化學(xué)農(nóng)藥是防治黃瓜枯萎病最常見的方法，且在一定程度上能夠快速地抑制黃瓜枯萎病，但其長期施用會導(dǎo)致環(huán)境污染，危害人體及牲畜健康[7]，也會導(dǎo)致病原菌耐藥性增強(qiáng)，防治效果差[8]。物理防治主要從栽培期間的管理、土壤的殺菌[9]及酸堿處理[10]入手。化學(xué)和物理的方法防治效果比較顯著，但要及時對植物的根部進(jìn)行保護(hù)，對種植土壤的酸堿性、透氣性進(jìn)行調(diào)節(jié)，否則極易受品種、天氣、土壤以及操作技術(shù)等因素的影響而導(dǎo)致該方法無法進(jìn)行大規(guī)模地推廣。近年來，人們?nèi)找孀非笫卟说钠焚|(zhì)和食用安全性，綠色、安全、環(huán)境友好型的防治方法應(yīng)運(yùn)而生。生物防治由于具有無污染、病原菌不易產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，日益成為國內(nèi)外研究者的研究熱點(diǎn)。生物防治可通過拮抗微生物自身或其次級代謝產(chǎn)物對病原菌產(chǎn)生抑制作用，削弱病原菌的致病力來達(dá)到防治的目的[11]。目前，研究天然高效的生物類抗菌物質(zhì)來防治黃瓜枯萎病已成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)具有廣譜抗菌的特性，能產(chǎn)生多種具有抑菌作用的次級代謝產(chǎn)物，是研究較多的一類生防細(xì)菌[12]。已有研究表明，解淀粉芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物多為脂肽、多肽、聚酮類和抗菌蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，在防治植物病害中起著至關(guān)重要的作用，如番茄青枯病[13]、玉米耐鹽性[14]、西瓜枯萎病[15]、黃瓜枯萎病[16]、黃瓜灰霉病[17]等。此外，解淀粉芽孢桿菌還能提高植物本身對非生物脅迫的耐受性，如高濃度鹽的威脅[14,18]。在種植業(yè)中，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可以作為蔬菜水果的綠色保鮮劑，能夠有效地抑制霉菌[19]。在養(yǎng)殖業(yè)中，解淀粉芽孢桿菌可作為飼料添加劑，在動物體內(nèi)調(diào)節(jié)并保持腸道內(nèi)的有益菌群的平衡與穩(wěn)定，從而改善動物的腸道健康[20]，幫助動物消化吸收，提高飼料養(yǎng)分的利用率。此外，解淀粉芽孢桿菌在凈化水源、防治水體富營養(yǎng)化等方面也發(fā)揮著積極的作用[19]。

本文以解淀粉芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)對象，探究其對尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡婢霓卓棺饔茫獾矸垩挎邨U菌發(fā)酵液的最佳發(fā)酵條件、理化穩(wěn)定性進(jìn)行評價，為后續(xù)開發(fā)生防菌劑提供理論依據(jù)。此外，本實(shí)驗(yàn)還探究了解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的抗氧化活性，以期進(jìn)一步拓寬解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

生防菌解淀粉芽孢桿菌SJ100001、病原菌尖孢鐮刀菌SJ300024均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基，海博生物有限公司；馬鈴薯葡萄糖液體(potato dextrose broth,PDB)培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，pH=7.0±0.2；LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，pH=7.0±0.2；NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，pH=7.3±0.1。

1.1.3 主要試劑

溶菌酶(Lysozyme)，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、鹽酸，西隴化工股份有限公司；胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶，上海麥克林生化科技有限公司；DPPH，Sigma Aldrich；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZQZY-AF8型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Synergy H1MF型多功能酶標(biāo)儀，BioTek公司；KT-30L型高壓蒸汽滅菌鍋，日本ALP儀器生產(chǎn)廠家；5810R型高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德股份有限公司；DK-8D型恒溫水浴鍋，金壇區(qū)金城海瀾儀器制造廠；DENVER UB-7型pH計，北京賽多麗絲科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 解淀粉芽孢桿菌SJ100001對尖孢鐮刀菌抑菌活性的測定

1.3.1.1 菌種活化

1)病原真菌活化。挑取真菌菌苔，接種到PDA固體培養(yǎng)基中心，28 ℃培養(yǎng)5 d。

2)生防細(xì)菌活化。挑取解淀粉芽孢桿菌SJ100001，三區(qū)劃線法于LB固體培養(yǎng)基劃線活化，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.3.1.2 抑菌活性的測定

采用平板對峙法測定抑菌活性，具體過程為：取尖孢鐮刀菌菌塊(直徑為0.7 cm)接種于PDA培養(yǎng)皿(直徑為9.0 cm)中心，在菌塊兩側(cè)1.5 cm處接種解淀粉芽孢桿菌。以尖孢鐮刀菌為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，連續(xù)觀察菌落的生長和生防菌對尖孢鐮刀菌的抑制情況。待對照菌株菌絲長滿培養(yǎng)皿時測量處理尖孢鐮刀菌菌落直徑，計算抑菌率[21-22],抑菌率計算公式為：

抑菌率/%=((對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-0.7))×100。

(1)

1.3.2 解淀粉芽孢桿菌SJ100001抑菌成分來源的測定

1.3.2.1 發(fā)酵液的制備

將活化的生防菌挑取1個單菌落接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱(37 ℃、180 r/min)發(fā)酵12 h，制得發(fā)酵種子液。取 1 mL種子液接種于250 mL的LB培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、180 r/min)培養(yǎng)48 h，4 ℃、12 000 r/min下離心10 min去除菌體沉淀，用0.22 μm濾膜過濾，獲得無菌濾液備用[23]。

1.3.2.2 菌體胞內(nèi)可溶物溶液的制備

收集1.3.2.1的菌體沉淀，加入適量生理鹽水重懸，4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，重復(fù)洗滌2～3次，收集菌體。使用25 mL生理鹽水將菌體重懸，得到菌體懸液，向菌體懸液中加入500 μL溶菌酶(100 mg/L)，于37 ℃水浴1 h。然后超聲破碎1 h，90 ℃加熱處理10 min，4 ℃、12 000 r/min下離心15 min，收集上清液，獲得菌體胞內(nèi)可溶物溶液備用[24]。

1.3.2.3 發(fā)酵液和菌體胞內(nèi)可溶物溶液抑菌活性的測定

參考牛津杯法[25]，并稍作修改。在PDA(直徑為9.0 cm)培養(yǎng)皿中心接種尖孢鐮刀菌菌塊(直徑為0.7 cm)，在菌塊兩側(cè)1.5 cm處放置牛津杯，在牛津杯中緩慢加入200 μL的發(fā)酵液或菌體胞內(nèi)可溶物溶液，以無菌水為對照[26]，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落的生長情況。培養(yǎng)72 h后觀察發(fā)酵液或菌體胞內(nèi)可溶物溶液對尖孢鐮刀菌的抑制效果，計算抑菌率，從而確定活性物質(zhì)的來源。抑菌率計算參照式(1)。

1.3.3 解淀粉芽孢桿菌SJ100001發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵液抑菌活性的影響

分別以5%接種量接種種子液于LB、NA和PDB培養(yǎng)基中，恒溫振蕩(37 ℃、180 r/min)培養(yǎng)48 h，得到LB、NA與PDB的發(fā)酵液。分別離心(4 ℃、12000 r/min)15 min，去除菌體沉淀，用0.22 μm濾膜過濾，獲得無菌濾液。測定不同培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌活性，計算抑菌率，抑菌率計算參照式(1)。

1.3.3.2 發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響

以1%接種量接種種子液于PDB培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、180 r/min)，分別培養(yǎng)0，1，2，3，4，5，6，7 d，獲得各個時間段的發(fā)酵液，并測定抑菌活性，計算抑制率，抑菌率計算參照式(1)。

1.3.3.3 發(fā)酵液最佳抑菌時間的測定

采用皿內(nèi)涂布法[27]測定抑菌活性，具體過程為：PDA培養(yǎng)皿內(nèi)加入200 μL無菌發(fā)酵液并快速涂干，在培養(yǎng)皿的中心放置尖孢鐮刀菌塊(直徑為0.7 cm)，以無菌水為對照組[28]，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔24 h觀察測量菌落直徑，用十字交叉法測量記錄菌落的直徑變化。待對照菌株菌絲長滿培養(yǎng)皿時停止觀察，計算抑菌率，抑菌率計算參照式(1)。

1.3.4 解淀粉芽孢桿菌SJ100001發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性

1.3.4.1 pH值對發(fā)酵液抑菌活性的影響

取7組潔凈的玻璃試管，每組分別加入5 mL的發(fā)酵液。實(shí)驗(yàn)組用0.2 moL/L的HCl和NaOH分別將發(fā)酵液調(diào)成pH=2～3，5～6，8～9，10～11，12～13。靜置24 h后調(diào)回原pH值[29]。對照組pH=7，加入無菌水為溶劑組[28]。參照1.3.1.2的抑菌方法計算抑制率，抑菌率計算參照式(1)。

1.3.4.2 溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響

取7組潔凈的玻璃試管，每組分別加入5 mL的發(fā)酵液。實(shí)驗(yàn)組分別置于恒溫水浴鍋或高溫高壓滅菌鍋保持40，60，80，100，121 ℃恒溫處理30，60 min。對照組放置室溫(25 ℃)，加入無菌水為溶劑組。參照1.3.1.2的抑菌方法計算抑制率，抑菌率計算參照式(1)。

1.3.4.3 蛋白酶對發(fā)酵液抑菌活性的影響

取7組潔凈的玻璃試管，每組分別加入5 mL的發(fā)酵液。實(shí)驗(yàn)組分別加入中性蛋白酶(50 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、酸性蛋白酶(100 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、胃蛋白酶(3000 U/mg)、木瓜蛋白酶(200 U/mg)，且使酶的終質(zhì)量濃度為1 g/L。把各個反應(yīng)混合液調(diào)到其酶最適的pH值與溫度，酶解4 h。處理完畢后，將每組置于沸水浴中滅活處理10 min。不加入任何蛋白酶為對照組，加入無菌水為溶劑組。參考1.3.2.3的牛津杯法對峙實(shí)驗(yàn)計算抑制率，抑菌率計算參照式(1)。

1.3.4.4 紫外照射對發(fā)酵液抑菌活性的影響

在潔凈的石英管中加入5 mL的發(fā)酵液，將其置于功率為15 W的紫外燈下分別照射1，2，3，4，24 h。以不做任何處理的發(fā)酵液為對照[30]，加入無菌水為溶劑組。參照1.3.1.2的抑菌方法計算抑制率，以考察紫外照射時間對活性物質(zhì)的影響，抑菌率計算參照式(1)。

1.3.5 解淀粉芽孢桿菌SJ100001發(fā)酵液的抗氧化能力測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

準(zhǔn)確稱取4 mg DPPH溶解在體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液中，配制成0.1 mmol/L的DPPH工作液。取不同濃度的發(fā)酵液100 μL分別加入到100 μL的DPPH工作液中，振蕩混勻后避光反應(yīng)30 min，以Vc(1 g/L)作為陽性對照，在517 nm處測定吸光度值(A1)；空白對照以超純水代替樣品測定吸光度值(A0)；樣品對照以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇代替DPPH溶液，測定吸光度值(A2)[31]。DPPH自由基清除率計算公式為：

DPPH自由基清除率/%=(1-(A2-A1)/A0)×100。

(2)

1.3.5.2 鐵離子還原能力測定

取100 μL的發(fā)酵液與250 μL的0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.6)、250 μL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵氰化鉀溶液混合，振蕩搖勻，置于50 ℃的恒溫水浴鍋中水浴30 min。水浴結(jié)束后，加入250 μL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸，將混合物3 000 r/min離心10 min。取250 μL上清液與250 μL的蒸餾水、50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%三氯化鐵混合，避光反應(yīng)10 min，在700 nm處測定溶液的吸光度值[32]，以Vc(1 g/L)作為陽性對照。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所有測定的數(shù)據(jù)均做3個平行，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用SPSS 26.0軟件分析并處理數(shù)據(jù)，P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異，采用Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行圖像處理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 解淀粉芽孢桿菌SJ100001對尖孢鐮刀菌的抑菌活性

解淀粉芽孢桿菌SJ100001的抑菌效果如圖1、表1所示。在平板對峙實(shí)驗(yàn)中，接種解淀粉芽孢桿菌SJ100001的實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯透明抑菌帶，抑菌率為62.80%，抑菌效果顯著，說明解淀粉芽孢桿菌SJ100001可分泌抑制尖孢鐮刀菌的物質(zhì)。

表1 解淀粉芽孢桿菌SJ100001的抑菌結(jié)果

2.2 解淀粉芽孢桿菌SJ100001抑菌成分的來源

為進(jìn)一步探究抑菌活性物質(zhì)的真正來源，采用牛津杯法檢測SJ100001菌體的發(fā)酵液和菌株懸液的抑菌活性，結(jié)果如圖2、表2所示。可見，與對照組相比，菌體懸液組無透明抑菌帶出現(xiàn)，尖孢鐮刀菌圈呈圓形生長，抑制率僅0.61%；實(shí)驗(yàn)組能看到尖孢鐮刀菌圈產(chǎn)生明顯形變，且抑菌活性達(dá)到了38.11%，提示發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌有明顯的抑菌作用，且產(chǎn)生抑菌活性的是SJ100001菌株的胞外次級代謝產(chǎn)物。

表2 抑菌活性物質(zhì)的抑菌活性(72 h)

2.3 解淀粉芽孢桿菌SJ100001的最佳發(fā)酵條件

2.3.1 培養(yǎng)基對發(fā)酵液抑菌活性的影響

SJ100001菌株在不同培養(yǎng)基中生長，抑菌活性也不同。已有實(shí)驗(yàn)表明[33]，培養(yǎng)基中的碳源、氮源和原始的pH值均會對活性物質(zhì)產(chǎn)生影響。由表3可知，利用NA、LB、PDB 3種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)SJ100001菌株，其發(fā)酵液中均會產(chǎn)生抑制尖孢鐮刀菌的活性物質(zhì)，但PDB培養(yǎng)基中SJ100001菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，其抑菌率高于其他2種培養(yǎng)基的。推測PDB培養(yǎng)基培養(yǎng)SJ100001菌株可產(chǎn)生更多的抑菌物質(zhì)，后期可將其作為發(fā)酵培養(yǎng)基，以富集更多活性物質(zhì)。

表3 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌活性(72 h)

2.3.2 發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響

SJ100001菌株發(fā)酵液的抑菌活性隨著發(fā)酵時間而變化，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵液的抑菌活性先升高后趨于平緩，在第3天時發(fā)酵液達(dá)到最大抑菌活性59.57%。推測菌株的次級代謝產(chǎn)物在發(fā)酵液中隨著時間逐漸累積，使發(fā)酵液的抑菌活性增強(qiáng)，在發(fā)酵3 d達(dá)到飽和，抑菌活性不再發(fā)生變化。

2.3.3 發(fā)酵液最佳抑菌時間

如圖4所示，SJ100001菌株發(fā)酵液在抑菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第2天時，其抑菌效果最佳，抑制率為54.65%。隨著抑菌實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，發(fā)酵液的抑菌效果降低，在第7天時其抑制率僅26.45%。推測3～4 d后尖孢鐮刀菌進(jìn)入指數(shù)生長期，導(dǎo)致后期SJ100001菌株發(fā)酵液的抑菌活性相對降低。

2.4 解淀粉芽孢桿菌SJ100001發(fā)酵液抑菌活性的穩(wěn)定性

2.4.1 pH值對發(fā)酵液抑菌活性的影響

如圖5所示，SJ100001菌株發(fā)酵液經(jīng)不同的酸堿處理后，抑菌活性與對照組相比有顯著差異。在pH=2～11時，抑菌活性均在52.00%以上，相比于對照組顯著上升(P<0.05)；在pH=12～13時，發(fā)酵液的抑菌活性僅0.41%，與對照組相比顯著下降了49.69%(P<0.01)。表明發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)對酸堿具有一定的耐受性，但在強(qiáng)堿的條件下會失活。

2.4.2 溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響

如圖6所示，發(fā)酵液經(jīng)40，60，80，100，121 ℃分別處理30與60 min后，依然具有較高的抑菌活性，并且活性保持在45%以上，與對照組(25 ℃)相比沒有顯著差異(P>0.05)。經(jīng)121 ℃高溫高壓處理60 min的發(fā)酵液，抑菌活性略低于對照組，但仍保持在44%以上。提示發(fā)酵液中的活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.4.3 紫外照射對發(fā)酵液抑菌活性的影響

如圖7所示，經(jīng)過不同時間的紫外線照射，發(fā)酵液的抑菌活性依然保持在30%以上，與未經(jīng)紫外照射處理的對照組相比沒有顯著下降(P>0.05)。此外，紫外照射24 h后，發(fā)酵液抑菌活性依舊沒有顯著下降。上述結(jié)果表明，SJ100001菌株發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)具有紫外穩(wěn)定性。

2.4.4 蛋白酶對發(fā)酵液抑菌活性的影響

在不同的蛋白酶酶解處理4 h后，SJ100001菌株發(fā)酵液對蛋白酶的穩(wěn)定性測定結(jié)果如圖8所示。由圖8可見，中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶的處理使發(fā)酵液的抑菌活性與對照組相比略微降低，但抑制率均在51%；而木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶的處理，相比于對照組的抑菌活性降低至49%左右。

不同蛋白酶特異性酶切位點(diǎn)不同，造成酶解后抑菌活性有差異，但抑菌活性均保持在49%以上，說明發(fā)酵液中的活性成分絕大部分沒有被蛋白酶破壞，依然具有一定的穩(wěn)定性?？沙醪酵茢?，SJ100001菌株產(chǎn)生的具有抑制尖孢鐮刀菌的次級代謝產(chǎn)物可能為非蛋白類化合物。

2.5 解淀粉芽孢桿菌SJ100001發(fā)酵液的抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除能力

如圖9所示，發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力與濃度呈正相關(guān)，隨著濃度的不斷提高，發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力從29.33%上升至87.26%，其抗氧化能力顯著提高(P<0.05)，表明發(fā)酵液具有一定的抗氧化活性。

2.5.2 鐵離子還原力測定

抗氧化物質(zhì)將Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與三氯化鐵發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成了藍(lán)色物質(zhì)，從而在700 nm下有強(qiáng)吸收峰，即抗氧化能力與吸收峰強(qiáng)度呈正比。

如圖10所示，鐵離子的還原力隨著發(fā)酵液濃度的增加而增加(P<0.05)，再次證明了發(fā)酵液具有抗氧化活性。

3 討論

已有研究結(jié)果顯示，解淀粉芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物如抗菌蛋白[34]、脂肽[35]、多肽類[36-37]等均具有抑菌效果[38-39]。Wong等[40]從解淀粉芽孢桿菌中分離得到相對分子質(zhì)量為50 ku的抗菌蛋白，該抗菌蛋白通過增加病原菌細(xì)胞膜的通透性而起到抑菌效果。Kaewklom等[41]從一株解淀粉芽孢桿菌SP-1-13LM中分離得到一種新型的多肽PPB，該多肽具有廣譜抑菌性，可有效抑制包括沙門氏菌在內(nèi)的多種病原菌的生長。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌SJ100001的次級代謝產(chǎn)物對尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡婢哂修卓棺饔?。

解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液抑菌活性受諸多因素的影響，實(shí)驗(yàn)表明，SJ100001菌株在PDB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)72 h時抑菌率最高，且抑菌活性物質(zhì)在第2 d時抑菌率最高，說明PDB培養(yǎng)基發(fā)酵可獲得濃度相對較高的抑菌物質(zhì)，并且僅需較短的時間就達(dá)到較好的抑菌效果，有利于后期分離純化抑菌物質(zhì)。該培養(yǎng)方法與解淀粉芽孢桿菌H15[42]、解淀粉芽孢桿菌CQN-2[43]和解淀粉芽孢桿菌K6[44]存在一定的差異，這種差異可能與菌株及其來源有關(guān)。

次級代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性影響其提取與開發(fā)。夏京津等[45]研究表明，解淀粉芽孢桿菌HE發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)對高溫、酸、堿和蛋白酶具有一定的耐受性。劉昆昂等[46]研究表明，解淀粉芽孢桿菌BA-KA4的胞外抑菌活性物質(zhì)能夠有效抑制灰霉病菌生長，且對溫度、pH值和紫外線的穩(wěn)定性較高。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SJ100001發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)同樣具有良好的耐酸堿性、熱穩(wěn)定性、紫外線以及蛋白酶穩(wěn)定性。解淀粉芽孢桿菌SJ100001產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物不僅具有抑菌作用，還具有良好的抗氧化能力。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探究解淀粉芽孢桿菌SJ100001對尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡婢囊志饔茫Y(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌SJ100001對尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡婢哂懈咝У霓卓棺饔?，且抑菌物質(zhì)是菌株的次級代謝產(chǎn)物。采用平板對峙法和牛津杯法，確定了SJ100001菌株最佳抑菌效果的發(fā)酵條件，即：37 ℃ 180 r/min搖床恒溫培養(yǎng)72 h，且通過紫外、溫度、酸堿、蛋白酶等穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了菌株發(fā)酵液具有較好的抑菌穩(wěn)定性和抗氧化性。