牛 達，吳佳睿，蘇國成，楊名平，江鋒，孫雪珂，周常義

(1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門中集信檢測技術(shù)有限公司，福建 廈門 361100；3.黃鶴樓科技園(集團)有限公司，湖北 武漢 430040)

0 引言

抗生素是一類由微生物或高等動植物產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的次級代謝產(chǎn)物，常用的抗生素有超過150種[1]。氯霉素類抗生素是一種常用的廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有效果，經(jīng)常作為藥物用于人畜疾病的治療[2]。據(jù)估計，到2030年，中國將成為最大的獸用抗生素消費國[3]。

30%～90%的抗生素會通過人體及動物的尿液、糞便等排泄物或生產(chǎn)廢水排入環(huán)境當中[4]。每年我國畜禽排泄物約有40億t，一部分直接排放，污染土壤環(huán)境，另一部分被制成有機肥料，間接污染土壤環(huán)境?？股刈罱K會通過徑流或浸出的方式對土壤、地表水及地下水造成污染[5]，如Li 等[6]在北京溫室蔬菜生產(chǎn)基地土壤中檢測到了μg/kg水平的多種抗生素，中國南部珠江三角洲的農(nóng)田土壤中也存在多種不同的抗生素污染[7]。由于大量施加畜禽糞便作肥料，有機蔬菜基地的土壤與常規(guī)田地相比具有更高濃度的抗生素。Hu 等[8]在中國北方蔬菜基地施用的糞肥中檢測到了多種高濃度抗生素，且土壤中抗生素的質(zhì)量比可達μg/kg至mg/kg(干重)[7]。有研究表明，抗生素濃度隨著土壤深度的增加而下降，菜地亞表層土壤抗生素總量為表層的4.5倍，氯霉素的含量增加了幾倍[9]。茶園亞表層土壤抗生素的種類分布，即便是在深度(>20 cm)的土層剖面仍能檢測到一定量的氯霉素。已有研究表明，食用回用廢水灌溉的玉米和水稻，人體氯霉素抗生素暴露量的日均人體暴露量可達0.34～21.8 μg[7]。因此，研究農(nóng)作物在殘留有抗生素土壤中的生長情況以及抗生素的吸收累積規(guī)律，對于抗生素污染土壤的合理利用和農(nóng)作物安全生產(chǎn)具有重要的參考價值。并且，已有研究表明，植物生長會吸收環(huán)境中的抗生素，如Wang等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜和小白菜生長均積累了磺胺甲惡唑、諾氟沙星，而檢測機構(gòu)卻很少對蔬菜類進行抗生素檢測。植物對抗生素的吸收、遷移、累積與抗生素性質(zhì)、植物個體差異有關(guān)，目前尚未明確植物吸收氯霉素抗生素的機制以及氯霉素類抗生素對于植物生長的影響，只有植物吸收抗生素的3個相關(guān)研究方向，即親脂性抗生素通常在植物根系上被吸收、抗生素可以聚集在植物液泡內(nèi)、通過植物細胞質(zhì)膜上電吸引作用牽引吸收[11]。本研究在含有不同濃度的3種抗生素的土壤中種植小白菜(BrassicachinensisL.)，探究土壤中氯霉素類抗生素對于小白菜生長影響，并通過UPLC-MS/MS檢測小白菜根莖葉各部分以及土壤中的3種抗生素含量，從而推斷3種氯霉素抗生素對小白菜生長的影響，同時采用富集系數(shù)、遷移系數(shù)分析3種氯霉素抗生素在土壤-小白菜系統(tǒng)中的累積遷移特性，并且對小白菜可食用部分進行人類健康風險評估，為小白菜在氯霉素抗生素污染土壤種植安全性評價研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 供試材料

供試小白菜為德州市德高蔬菜種苗研究所生產(chǎn)的不結(jié)球小白菜“雞毛”種。供試土壤為山東壽光農(nóng)產(chǎn)品公司的有機營養(yǎng)土，pH=6.5，有機質(zhì)質(zhì)量比為31.2 g/kg，氮質(zhì)量比為17.6 g/kg，磷質(zhì)量比為11.4 g/kg。

1.1.2 主要試劑

氯霉素標準品(99.24%)；甲砜霉素標準品(98.5%)；氟苯尼考標準品(99.1%)，Dr.Ehrenstorfer；氯霉素～D5標準品(100 mg/L)，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心；甲酸(色譜純)，美國Tedia公司；甲醇、乙腈(色譜純/分析純)，德國默克試劑公司；乙酸乙酯(分析純)，正己烷(色譜純)，百靈威科技有限公司；氯化鈉(分析純)，無水硫酸鈉(分析純)，西隴科學股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

賽默飛TSQ Endura三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，賽默飛UItiMate 3000超高效液相色譜儀。

1.2 栽培實驗設(shè)計

種植箱規(guī)格為80 cm×40 cm×26 cm，每箱供試土壤10 kg。實驗選擇3種抗生素混合污染處理，設(shè)置4個污染水平：抗生素質(zhì)量比分別為0，5，10，15 mg/kg，分別為空白組和3個實驗組，每個處理3組平行。小白菜種植密度為左右間隔6 cm，前后間隔4 cm，每天澆水，在自然光照環(huán)境下培育。分別檢測種植后的土壤中氯霉素抗生素含量，以及成熟小白菜的各部分氯霉素抗生素含量。

1.3 樣品采集與處理

1.3.1 小白菜樣品檢測

小白菜種植分為空白對照組和處理組，33 d種植成熟后，沖洗，剪刀分離根莖葉，小型高速斬拌機打碎，取空白和處理組各6份，4組平行，2組加標，加標和內(nèi)標水平均為1 μg /kg。

樣品前處理參考李亞寧等[12]和王旭強等[13]的方法進行：清洗干凈小白菜，用小型高速斬拌機進行處理，裝入干燥潔凈容器在冷凍室備用。樣品常溫下解凍，準確稱取5.00 g試樣于潔凈干燥的50 mL塑料離心管中，加入乙腈15.0 mL，振蕩5 min，25 ℃超聲20 min，依次加入5.0 g氯化鈉、8.0 g無水硫酸鈉，渦旋3 min，離心機8 000 r/min離心3 min。取上清液于另一個50 mL塑料離心管后，殘渣重復上述步驟合并上清液，40 ℃氮氣吹干，用5 mL超純水溶解殘渣。凈化處理：用3.0 mL甲醇和5.0 mL超純水預處理連接的Oasis HLB柱(60 mg，3 mL)與過柱提取裝置，然后提取液以3.0 mL/min的速度全部過柱后，用5 mL×2超純水淋洗后再用5.0 mLV(乙腈)∶V(超純水)=1∶7淋洗柱子，用減壓抽濾裝置于負壓下抽干10 min。最后用10.0 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于15 mL塑料離心管中，在40 ℃下氮氣吹干，用V(乙腈)∶V(超純水)=1∶4定容到1.0 mL，過0.22 μm有機相濾膜，待UPLC-MS/MS上機檢測。

1.3.2 土壤樣品檢測

種植小白菜33 d后的土壤分空白組和樣品組共4組，取空白組及3組不同水平混合污染土壤各6份，4組平行，2組加標，加標和內(nèi)標水平均為1 μg/kg。

樣品前處理參考李亞寧等[12]和章程等[14]的方法進行：將土壤樣品自然條件下風干，干燥密閉容器內(nèi)低溫保存。稱取5.00 g土壤試樣于潔凈干燥50.0 mL塑料離心管中，加入超純水8.0 mL，渦旋1.0 min,振蕩15 min，加入體積分數(shù)為1%氨化乙腈10.0 mL，25 ℃超聲20 min，依次加入5.0 g氯化鈉、8.0 g無水硫酸鈉，渦旋3 min，離心機8 000 r/min離心3 min，取上清液于另一個50 mL塑料離心管中，殘渣加入體積分數(shù)為1%氨化乙腈 10.0 mL，重復上述步驟合并上清液，40 ℃氮氣吹干，5 mL超純水溶解殘渣。凈化步驟同上。

1.4 液質(zhì)聯(lián)用條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫箱溫度為30 ℃，進樣量為2 μL；流動相流速為0.3 mL/min；流動相 A為超純水，流動相 B為甲醇(色譜純)。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure of mobile phase序號Serialnumbert/min流速Flow rate/(mL·min-1)流動相比例Mobile phase/%A相Phase AB相Phase B100.300802020.50.300802033.50.30059544.30.30059554.50.300802067.00.3008020

質(zhì)譜條件：離子源類型為電噴霧離子源；噴涂電壓為靜態(tài)；負離子噴霧電壓為3 200 V；鞘氣、輔助氣和反吹氣流速分別為30，10，0 arb；離子傳輸管溫度為300 ℃；噴霧溫度為250 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用賽默飛TSQ Quantum series軟件對數(shù)據(jù)進行采集，用Excel 2010和SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行計算和統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(ONEWAY-ANOVA)檢驗其相關(guān)性和顯著性，P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義，利用GraphPad Prism進行圖表繪制。

評價抗生素在土壤-植物體系內(nèi)吸收、轉(zhuǎn)化和遷移過程中的富集狀況和轉(zhuǎn)移能力分別用生物富集系數(shù)(bioconcentration factor，BCF)[15-16]和轉(zhuǎn)運系數(shù)(transport factor，TF)[17]表示，計算公式如下：

BCF=Ci/Bi,

(1)

TF=Cs/Cr。

(2)

其中：Ci表示小白菜某部位抗生素的質(zhì)量比(μg/kg)；Bi表示栽種小白菜的土壤中抗生素的質(zhì)量比(μg/kg)；Cs表示小白菜某抗生素地上部分的質(zhì)量比(μg/kg)；Cr表示栽種小白菜某抗生素地下部分的質(zhì)量比(μg/kg)。

人體對抗生素的每日預測攝入量(estimated daily intake，EDI)根據(jù)式(3)計算， 抗生素對人體健康的風險商(hazard quotient，HQ)根據(jù)式(4)計算[18]。

EDI=C×FIR/BW,

(3)

HQ=EDI/ADI。

(4)

其中：C為食品中的抗生素質(zhì)量比(μg/kg，以鮮重計)，鮮基含量以干基含量和含水量換算得到；FIR(food intake recommendation)為每日攝取食物的量(kg)，世界衛(wèi)生組織建議每天攝入 400 g 蔬菜[19]，《中國居民膳食指南(2016)》建議中小學生和成年人每人每天對蔬菜的需求量為300～500 g[20]，本文取每日攝食蔬菜400 g計算；BW(body weight)為人體平均體重(kg)，分別設(shè)定成年人體重為65 kg，兒童(7歲)體重為25 kg；ADI為每日容許攝入量(allowable daily intake)，取值參照WHO的規(guī)定[19]。

2 實驗結(jié)果及討論

2.1 不同濃度抗生素對小白菜生長的影響及遷移特征

2.1.1 不同濃度抗生素培養(yǎng)下小白菜各部分累積

由圖1可知，本次實驗空白組均未檢測出3種抗生素，土壤中添加抗生素的實驗組，小白菜各部分對于3種抗生素均有吸收并富集的能力。氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素在小白菜中的累積量分別為4.71～410，0～0.359，0～0.161 μg/kg；5 mg/kg和10 mg/kg處理組甲砜霉素均未在小白菜中檢出；隨著土壤中氯霉素和氟苯尼考濃度的增加，小白菜的吸收量也在顯著增加；25 mg/kg處理組中，小白菜不同部位甲砜霉素累積量為根>莖>葉；氯霉素和氟苯尼考在小白菜不同部位累積量表現(xiàn)為葉>莖>根；3種不同濃度處理組中，氟苯尼考在小白菜中的累積量最大。小白菜對3種氯霉素類抗生素的累積量與土壤中抗生素濃度呈正相關(guān)。

Kumar等[21]的研究顯示，卷心菜和大蔥都可吸收四環(huán)素并將其積累于各組織中。楊曉靜等[22]的研究也表明，泥炭土基質(zhì)條件下培養(yǎng)的蔬菜中，莖葉中的抗生素濃度高于根部。植物體內(nèi)抗生素的含量與土壤、抗生素類型、植物品種、植物組織部位等有關(guān)。在本實驗中，甲砜霉素累積量少可能是因為其具有較強的水溶性，自然條件下使其溶于雨水中，由于種植盆的結(jié)構(gòu)，溶于雨水的甲砜霉素流向土壤深層或者直接流出種植盆，所以吸收量相對較少；也可能是因為復合抗生素之間的相互作用對小白菜轉(zhuǎn)運機制產(chǎn)生拮抗作用導致；或與小白菜生長周期及其特征有關(guān)，甲砜霉素存在于下層土壤且轉(zhuǎn)移到上層的能力有限，小白菜生長周期較短，因此未被小白菜吸收。氟苯尼考在小白菜葉中的累積量顯著大于根部，說明抗生素由小白菜根系吸收后被儲存在葉片中。氯霉素和甲砜霉素在小白菜的各部分累積量無明顯差別，說明這2種抗生素沒有被小白菜大量儲存，但仍會隨著根部的吸收進入小白菜體內(nèi)。

2.1.2 含有抗生素土壤培養(yǎng)下小白菜的富集系數(shù)

小白菜不同部位對于3種氯霉素類抗生素的富集能力如圖2所示，可見，小白菜各部分的氯霉素富集系數(shù)隨著土壤濃度的增加均顯著降低。氯霉素在小白菜各部分的富集系數(shù)為0.039～0.154，富集系數(shù)較小，在高濃度時已經(jīng)無法繼續(xù)富集，所以，土壤濃度越高，富集系數(shù)越低；小白菜各部分的氟苯尼考富集系數(shù)隨土壤濃度的增加先顯著增加后顯著減少，氟苯尼考在小白菜各部分的富集系數(shù)為0.122～2.87，由于其富集系數(shù)較高，隨著土壤濃度的不斷升高，富集能力在中濃度時達到頂峰，隨后富集系數(shù)降低。各部分抗生素的富集系數(shù)大小為：氯霉素為葉>莖>根，甲砜霉素為根>莖>葉，氟苯尼考為葉>莖>根。不同植物對不同抗生素的富集能力有強弱之分，根據(jù)生物富集系數(shù)程度分級，小白菜對甲砜霉素和氯霉素可視為無富集，對氟苯尼考有輕微富集能力。

Miller等[23]認為，在植物根部吸收化合物時，只有溶解在土壤孔隙水中的化合物才會被植物吸收。因此，環(huán)境因素、植物種類和抗生素自身理化性質(zhì)決定了該種抗生素在某種植物中的遷移和累積效率。氟苯尼考比其他2種抗生素親脂性更強，考慮到亨利系數(shù)值高于10-4，且親水性較弱的物質(zhì)易揮發(fā)，通過植物葉片表面的氣孔進入植物體內(nèi)，被截留在葉片角質(zhì)層的類脂類物質(zhì)中。甲砜霉素和氯霉素則主要靠根系吸收，小白菜對其富集能力較弱。

2.1.3 含有抗生素土壤培養(yǎng)下小白菜的轉(zhuǎn)運系數(shù)

如圖3所示，隨著土壤氟苯尼考濃度增加，氟苯尼考轉(zhuǎn)運系數(shù)顯著增加，而氯霉素轉(zhuǎn)運系數(shù)則無顯著性變化。本次實驗結(jié)果表明，3種氯霉素的轉(zhuǎn)運系數(shù)均大于1，說明3種抗生素容易被小白菜根部吸收并向上轉(zhuǎn)運。由圖3還可以看出，3種抗生素均可從根部遷移至地上部分，氟苯尼考轉(zhuǎn)運系數(shù)為6.97～14.58，氯霉素轉(zhuǎn)運系數(shù)為3.23～4.16，甲砜霉素轉(zhuǎn)運系數(shù)為1.41～1.63，氟苯尼考>氯霉素>甲砜霉素。轉(zhuǎn)運系數(shù)越大，說明污染物越容易通過根部的吸收進而向植物地上的其他部分遷移，遷移能力為氟苯尼考>氯霉素>甲砜霉素。李亞寧等[12]對磺胺類抗生素磺胺甲惡唑污染的土地上種植辣椒的研究結(jié)果表明，其地上部分的質(zhì)量比約為其在根中質(zhì)量比的2倍，與本實驗結(jié)果相符。

2.2 土壤-小白菜體系中氯霉素類抗生素健康風險評估

由表2可知，隨著土壤中3種混合氯霉素類抗生素含量的增加，小白菜中的氯霉素和氟苯尼考的含量顯著增加，對人體的危害也會增大。由于兒童攝入蔬菜量相對自身體重比例更高，因此，兒童攝入含抗生素的蔬菜危害大于成人。對于非藥用抗生素通過飲食長期低劑量暴露對人體健康造成的威脅，通常采用HQ進行評估[24-25]。該方法同時適用于飲用水、動物性食品、蔬菜和糧食等，通常認為，當HQ>1時存在風險[26]，但也有學者認為當HQ>0.1時便有潛在的風險[27]。數(shù)據(jù)顯示，當氟苯尼考在土壤中的質(zhì)量比達到10 mg/kg時，成人和兒童的HQ>0.1，說明具有潛在的健康風險。氟苯尼考在土壤中的質(zhì)量比達到25 mg/kg，兒童的HQ>1，說明對兒童的健康構(gòu)成威脅。本次實驗的所有處理組中甲砜霉素HQ均小于0.01。實驗中氟苯尼考抗生素的HQ值大于甲砜霉素。由于國家規(guī)定在所有食品中氯霉素不得檢出，所以沒有氯霉素ADI值，而本次實驗證明，土壤中的氯霉素會遷移進入小白菜體內(nèi)從而對人體造成危害。

表2 通過小白菜攝入的氯霉素類抗生素對人體健康的潛在風險

3 結(jié)論

1)小白菜體內(nèi)3種氯霉素類抗生素累積量隨土壤含量增加而增加；氟苯尼考與氯霉素在小白菜不同部位的累積狀況是葉>莖>根；甲砜霉素在小白菜體內(nèi)的累積狀況是根>莖>葉。氟苯尼考富集系數(shù)超過氯霉素10倍以上，超過甲砜霉素100倍以上；在小白菜葉中，氟苯尼考生物富集系數(shù)達到中度富集的程度；3種抗生素均易從根部遷移到小白菜地上部分，小白菜中3種抗生素的遷移能力為氟苯尼考>甲砜霉素>氯霉素。

2)當土壤中甲砜霉素質(zhì)量比低于25 mg/kg時，生長的小白菜對人類健康沒有風險(HQ<0.1)；當土壤中氟苯尼考質(zhì)量比高于10 mg/kg時，生長的小白菜對人類健康有潛在的風險(HQ>0.1)；當土壤中氟苯尼考質(zhì)量比高于25 mg/kg時，生長的小白菜對兒童健康有風險(HQ>1)。土壤中氯霉素類抗生素殘留對小白菜的生長和累積有一定影響，種植和食用時需考慮其風險。