陳小琴，翁細(xì)金，孫海琴，陳利民

溫州市中心醫(yī)院 超聲科，浙江 溫州 325000

乳腺癌已成為發(fā)病率和病死率最高的女性惡性腫瘤，對(duì)廣大女性的身心健康造成嚴(yán)重危害[1]。臨床上乳腺癌需要盡早診斷，以進(jìn)行及時(shí)有效的治療。超聲是臨床上診斷乳腺癌的主要手段，尤其是超聲造影[2]，但大部分研究主要關(guān)注乳腺良惡性腫塊的鑒別，關(guān)于超聲造影特征與預(yù)后的相關(guān)性報(bào)道較少。乳腺癌的病理學(xué)改變是影像學(xué)診斷的重要基礎(chǔ)，特別是p53、Ki-67、雌激素受體（estrogen receptor, ER）及孕激素受體（progesterone receptor, PR）等免疫組化標(biāo)記物參數(shù)被認(rèn)為在乳腺癌診斷、治療方案選擇及預(yù)后評(píng)估等方面有重要價(jià)值[3-4]，但這需要在組織學(xué)標(biāo)本中取得，因此探索超聲造影無(wú)創(chuàng)性評(píng)估乳腺癌預(yù)后很有必要。本研究通過(guò)分析乳腺癌超聲造影特征性表現(xiàn)，探討超聲造影與乳腺癌免疫組化標(biāo)記物預(yù)后因素的相關(guān)性，為術(shù)前無(wú)創(chuàng)評(píng)估乳腺癌預(yù)后提供新思路。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2019年1月至2020年12月溫州市中心醫(yī)院收診的乳腺腫塊患者作為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：①因乳房疼痛、乳頭溢液、乳房捫及包塊、腋窩淋巴結(jié)腫大等而就診，初步診斷為乳腺腫塊，需進(jìn)一步檢查以明確乳腺腫塊性質(zhì)；②首次確診，既往無(wú)手術(shù)、放化療等抗腫瘤治療病史；③女性；④年齡18～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因存在認(rèn)知障礙、精神障礙而無(wú)法配合檢查；②既往有胸部手術(shù)史；③合并嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病或傳染性疾病不能行手術(shù)治療者；④轉(zhuǎn)移性乳腺癌或合并其他部位原發(fā)惡性腫瘤；⑤雙側(cè)乳腺癌者；⑤存在超聲造影禁忌，無(wú)法完成超聲造影檢查者。共入組150例患者，年齡30～64（47.6±9.4）歲。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批許可，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查：①常規(guī)超聲檢查：采用三星Rs80a彩色多普勒超聲診斷儀，配備7.5～12 MHz頻率探頭，患者取平臥位，雙手上舉顯露雙側(cè)腋窩，在患側(cè)乳房涂抹耦合劑，將超聲探頭置于患者乳房進(jìn)行掃描并采集超聲圖。②超聲造影檢查：由一位擁有5年以上乳腺超聲檢查經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師完成。將超聲診斷儀設(shè)置為超聲造影模式，經(jīng)肘靜脈快速注入2 mL聲諾維造影劑，再快速注入5 mL 0.9%氯化鈉溶液沖洗，啟動(dòng)動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)按鈕、計(jì)時(shí)按鈕，保存成像過(guò)程，整個(gè)造影過(guò)程至少3 min。超聲造影成像結(jié)果由2名超聲診斷經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師分別閱片給出診斷意見(jiàn)，兩位醫(yī)師對(duì)患者的臨床數(shù)據(jù)都不知情。如診斷意見(jiàn)不統(tǒng)一，需進(jìn)行商討后得出統(tǒng)一意見(jiàn)。

常規(guī)超聲對(duì)乳腺癌判定標(biāo)準(zhǔn)[5-7]：①結(jié)節(jié)邊界模糊，可見(jiàn)毛刺；②結(jié)節(jié)呈低回聲或極低回聲，周邊無(wú)低回聲暈，或暈環(huán)寬度不規(guī)則；③結(jié)節(jié)內(nèi)微小鈣化；④縱橫比≥1；⑤內(nèi)部可見(jiàn)雜亂血流（III型血流），且阻力指數(shù)大于0.7。滿足以上特征中一項(xiàng)即可診斷惡性，否則診斷為良性。

超聲造影乳腺癌判定標(biāo)準(zhǔn)[5-7]：如病灶形態(tài)不規(guī)則，邊界模糊，內(nèi)部存在豐富血流信號(hào)，血流信號(hào)分級(jí)為2～3級(jí)，造影后出現(xiàn)強(qiáng)化反應(yīng)，即可判斷為乳腺惡性病變。

1.2.2 病灶組織免疫組化染色：病灶組織取出后采用10%甲醛溶液固定組織標(biāo)本，石蠟包埋處理，切成4 μm的薄片，采用二甲苯梯度進(jìn)行脫蠟處理，采用梯度乙醇進(jìn)行脫苯處理，直至水化，再采用枸櫞酸緩沖液修復(fù)組織標(biāo)本，滴加過(guò)氧化氫溶液，在室溫下孵育10 min，再將組織標(biāo)本分為4份，分別置于4個(gè)孔中，在孔內(nèi)分別滴加p53、Ki-67、ER、PR抗體，在室溫下持續(xù)孵育30 min后采用PBS緩沖液沖洗，采用DAB顯色液對(duì)其進(jìn)行顯色處理，采用蘇木精-伊紅染色，在電子光鏡下隨機(jī)選取100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞核內(nèi)是否出現(xiàn)棕黃色顆粒物來(lái)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)St.Gallen國(guó)際專(zhuān)家共識(shí)[8]，相關(guān)免疫組化標(biāo)記物增殖指數(shù)≥14%記為陽(yáng)性，＜14%記為陰性。分級(jí)方法：無(wú)棕黃色顆粒物出現(xiàn)即陰性（-），棕黃色顆粒物占比＜30%即弱陽(yáng)性（+），棕黃色顆粒物占比30%～50%即陽(yáng)性（++），棕黃色顆粒物占比＞50%即強(qiáng)陽(yáng)性（+++），+～+++均為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo) 以手術(shù)和（或）穿刺活檢病理為金標(biāo)準(zhǔn)，比較常規(guī)超聲、超聲造影在乳腺癌診斷中的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。比較乳腺癌患者與乳腺良性腫塊患者造影劑開(kāi)始增強(qiáng)時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、峰值強(qiáng)度、峰值消退時(shí)間，統(tǒng)計(jì)乳腺癌患者不同超聲造影特征（有無(wú)血流灌注缺損、造影后腫瘤范圍較造影前有無(wú)擴(kuò)大、感興趣區(qū)強(qiáng)化程度）下的p53、Ki-67、ER、PR陽(yáng)性表達(dá)率，分析p53、Ki-67、ER、PR陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌患者超聲造影特征之間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，2組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)。采用Spearman法對(duì)數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲造影與常規(guī)超聲對(duì)乳腺癌的診斷結(jié)果分析 150例乳腺腫塊患者中，病理確診乳腺癌83例（包括非浸潤(rùn)性導(dǎo)管原位癌24例，非浸潤(rùn)性小葉原位癌13例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌30例，浸潤(rùn)性小葉癌16例），乳腺良性腫塊67例。

超聲造影在乳腺癌診斷中的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均較常規(guī)超聲更高（P＜0.05）。見(jiàn)表1、表2。

表1 超聲造影與常規(guī)超聲對(duì)乳腺癌的診斷結(jié)果（例）

表2 超聲造影與常規(guī)超聲診斷乳腺癌的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較（n=150，%）

2.2 乳腺惡性腫塊與良性腫塊的超聲造影定量指標(biāo)比較 乳腺惡性腫塊的峰值強(qiáng)度高于乳腺良性腫塊（P＜0.05），達(dá)峰時(shí)間、開(kāi)始增強(qiáng)時(shí)間、峰值消退時(shí)間均短于乳腺良性腫塊（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 乳腺惡性腫塊與乳腺良性腫塊的超聲造影定量指標(biāo)比較（±s）

表3 乳腺惡性腫塊與乳腺良性腫塊的超聲造影定量指標(biāo)比較（±s）

組別 例數(shù) 峰值強(qiáng)度（dB） 達(dá)峰時(shí)間（s） 開(kāi)始增強(qiáng)時(shí)間（s） 峰值消退時(shí)間（s）乳腺惡性腫塊 83 19.48±5.50 17.06±2.19 11.79±2.33 5.07±1.42乳腺良性腫塊 67 15.25±7.09 20.35±2.87 15.21±3.05 7.78±2.36 t 1.994 7.962 7.784 8.695 P＜0.029 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 乳腺惡性腫塊不同超聲造影特征p53、Ki-67、ER、PR陽(yáng)性表達(dá)率比較 在乳腺癌患者超聲造影圖像中，存在51例血流灌注缺損，29例造影后范圍擴(kuò)大，46例高增強(qiáng)。血流灌注缺損者的p53、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)血流灌注缺損者，ER、PR陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于無(wú)血流灌注缺損者（均P＜0.01）；造影后腫瘤范圍較造影前擴(kuò)大者的p53、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于造影后腫瘤范圍較造影前未擴(kuò)大者，ER、PR陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于造影后腫瘤范圍較造影前未擴(kuò)大者（均P＜0.01）；超聲造影高增強(qiáng)者的p53、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于低增強(qiáng)者，ER、PR陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于低增強(qiáng)者（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 乳腺惡性腫塊不同超聲造影特征的p53、Ki-67、ER、PR陽(yáng)性表達(dá)率比較[例（%）]

2.4 乳腺癌患者p53、Ki-67、ER、PR陽(yáng)性表達(dá)與超聲造影特征之間的相關(guān)性分析 乳腺癌患者超聲造影圖像中的血流灌注缺損與p53、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)，與ER、PR陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；造影后腫瘤范圍較造影前擴(kuò)大與p53、Ki-67 陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與ER、PR陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.01）；高增強(qiáng)與p53、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)，與ER、PR陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。見(jiàn)表5。

表5 乳腺癌患者p53、Ki-67、ER、PR陽(yáng)性表達(dá)與超聲造影特征之間的相關(guān)性

3 討論

超聲影像學(xué)檢查是乳腺癌術(shù)前診斷的主要方法[2，4，7]，但常規(guī)超聲圖像易受到患者胸部脂肪組織的干擾，導(dǎo)致成像清晰度下降。超聲造影技術(shù)可根據(jù)造影劑在乳腺病灶的分布及強(qiáng)化情況，利用彩色信號(hào)顯示乳腺腫塊的血流分布情況，可更加清晰地顯示乳腺腫塊形態(tài)、內(nèi)部回聲、血流分布情況，更利于醫(yī)師判斷乳腺腫塊性質(zhì)，且超聲造影檢查時(shí)利用造影劑可對(duì)乳腺病灶輪廓進(jìn)行強(qiáng)化顯示，減輕胸部脂肪組織對(duì)超聲成像的干擾[7，9]。

乳腺癌因?yàn)槟[瘤代謝活躍，氧和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)相對(duì)不足，導(dǎo)致局部缺血性壞死，超聲造影會(huì)出現(xiàn)不均勻增強(qiáng)甚至血流灌注缺損[9]。另外其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與新生血管形成密切相關(guān)，病變血管管徑往往不規(guī)則，容易出現(xiàn)動(dòng)靜脈分流及竇道，而導(dǎo)致腫瘤血管壁的不完整，尤其是那些沒(méi)有肌層的腫瘤血管是血液大量灌注的基礎(chǔ)，從而出現(xiàn)超聲造影的高增強(qiáng)[9-10]，超聲造影的這些優(yōu)勢(shì)為評(píng)估乳腺癌提供了有效的信息。對(duì)比乳腺癌患者與乳腺良性腫塊患者的超聲造影定量參數(shù)后發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者的峰值強(qiáng)度高于乳腺良性腫塊患者，乳腺癌患者的達(dá)峰時(shí)間、開(kāi)始增強(qiáng)時(shí)間、峰值消退時(shí)間均短于乳腺良性腫塊患者，本研究結(jié)果還顯示超聲造影在乳腺癌診斷中的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均較常規(guī)超聲更高，說(shuō)明超聲造影可減少乳腺癌漏診和誤診情況，也提示乳腺癌超聲造影的必要性。

p53、Ki-67、ER、PR等免疫組化標(biāo)記物指標(biāo)被作為乳腺癌個(gè)體化診療及預(yù)后評(píng)估的重要標(biāo)志物越來(lái)越受到重視[3-4，6]。p53作為一種抑癌基因，可發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，但p53在人體內(nèi)極易發(fā)生突變，一旦p53發(fā)生突變，會(huì)喪失抑癌作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞活化、增殖，增加了細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[4]；Ki-67屬于細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原，反映細(xì)胞的增殖活性，Ki-67的高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[11-12]；雌激素、孕激素可刺激PAK4活化，促進(jìn)ER、PR轉(zhuǎn)錄，促使乳腺癌細(xì)胞增殖[3-4]。但是臨床上乳腺癌預(yù)后相關(guān)的免疫組化標(biāo)記物指標(biāo)的檢測(cè)手段均是侵入性的，且受檢測(cè)技術(shù)限制，無(wú)法在術(shù)前快捷、有效地獲取。

有研究表明，乳腺癌患者的免疫組化指標(biāo)可能與超聲造影特征有關(guān)，通過(guò)超聲造影影像學(xué)特征預(yù)測(cè)免疫組化標(biāo)記物增殖指數(shù)具有一定的潛在臨床價(jià)值[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者超聲造影圖像中的血流灌注缺損、高增強(qiáng)與p53、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)，與ER、PR陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示超聲造影檢查存在血流灌注充盈缺損及高增強(qiáng)的病例可作為新輔助化療有效的預(yù)測(cè)特征，另外超聲造影出現(xiàn)血流灌注缺損、高增強(qiáng)可能是患者預(yù)后不良的一個(gè)特征，可以在術(shù)前為臨床診療提供初步評(píng)估。然而由于研究結(jié)果相關(guān)性并不是特別高，尚無(wú)法替代ER和ki-67來(lái)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。另外造影后腫瘤范圍較造影前擴(kuò)大與p53、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與ER、PR陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)，也證實(shí)了乳腺癌免疫組化指標(biāo)與超聲造影特征之間的密切關(guān)聯(lián)。

綜上，基于非侵入性的超聲造影不僅可提高乳腺癌的定性診斷效能，超聲造影的血流灌注缺損、高增強(qiáng)及造影后腫瘤范圍較造影前擴(kuò)大等特征與乳腺癌患者免疫組化標(biāo)記物指標(biāo)存在密切關(guān)聯(lián)，可反映乳腺癌的生物學(xué)特性，具有一定的預(yù)測(cè)效能，可作為乳腺癌診療及預(yù)后評(píng)估的無(wú)創(chuàng)性參考手段。