徐云芝，徐雪琴，唐少華，周麗麗，李煥錚

溫州市中心醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心，浙江 溫州 325000

性染色體非整倍體疾?。╯ex chromosome aneuploidies, SCAs）主要包括Turner綜合征（45,X）、超雌綜合征（47, XXX）、克氏綜合征（47, XXY）、超雄綜合征（47, XYY）。人群發(fā)病率為1/500，活產(chǎn)率為1/350～1/400[1-2]。臨床表現(xiàn)為女性閉經(jīng)、不孕、反復(fù)流產(chǎn)，男性無精子癥、不育，可伴有其他臟器結(jié)構(gòu)和功能異常，以及一定程度的智力低下和精神障礙等。性染色體異常很少致死，其中大部分（45,X）胎兒在孕期會自然流產(chǎn)，而其他SCAs胎兒很難通過B超檢查發(fā)現(xiàn)，以致產(chǎn)前SCAs容易漏診[3]。

1997年LO等[4]首次在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)胎兒游離DNA，并由此開辟了全新的無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（non-invasive prenatal testing, NIPT）技術(shù)領(lǐng)域。2011年NIPT首次用于21-三體的商業(yè)化檢測，后又用于13-三體、18-三體等。除檢測常染色體疾病外，NIPT對性染色體非整倍體的檢測也有較高的準(zhǔn)確性[5-6]。

本研究通過分析溫州市中心醫(yī)院行NIPT或擴(kuò)展性NIPT（NIPT PLUS）篩查胎兒SCAs的檢出效能，評價其在胎兒SCAs中的臨床應(yīng)用價值，為提高NIPT在臨床的應(yīng)用提供參考與借鑒。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年1月至2019年12月于溫州市中心醫(yī)院行NIPT普通三項或NIPT PLUS的單活胎孕婦27 116 例為研究對象，其中NIPT普通三項有15 218例，NIPT PLUS有11 948例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)B超檢查確定孕周12～22+6周；②單胎妊娠；③知情同意下自愿行NIPT或NIPT PLUS檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕婦患染色體異常疾??；②孕婦接受過移植手術(shù)、免疫治療等。檢測結(jié)果陽性的孕婦被召回，建議遺傳咨詢，經(jīng)本人及家屬同意行羊膜腔穿刺及羊水染色體核型分析。本研究經(jīng)溫州市中心醫(yī)院倫理委員會審批，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 NIPT檢查：抽取孕婦10 mL外周血到EDTA抗凝管中，離心，取上層血漿，采用北京貝瑞公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取胎兒游離DNA，構(gòu)建文庫，通過Illumina高通量基因測序平臺進(jìn)行樣本測序檢測。下機(jī)后通過計算X或Y染色體reads所占比例和Z值來評估性染色體非整倍體異常情況[Z=（糾正后的樣本%chrN-參考樣本的%chrN平均值）/參考樣本的%chrN的標(biāo)準(zhǔn)差]。判斷規(guī)則[7]如下：chrX的Z值參考范圍設(shè)為-2.91～2.91，chrY的Z值閾值設(shè)為3。對于正常男性胎兒，其chrX的Z值和chrY的Z值呈負(fù)線性相關(guān)，因此當(dāng)chrX的Z值為-2.91～2.91，chrY的Z值小于3，則胎兒性別核型為XX；當(dāng)chrX的Z值小于-2.91，chrY的Z值小于3，則胎兒性別核型為X；當(dāng)chrX的Z值大于2.91，chrY的Z值小于3，則胎兒性別核型為XXX；當(dāng)chrX的Z值為-2.91～2.91，chrY的Z值大于3，則胎兒性別核型為XYY；當(dāng)chrX的Z值小于-2.91，chrY的Z值大于3，且符合線性關(guān)系，則胎兒性別核型為XY，否則為XYY。

1.2.2 NIPT PLUS檢查：同上述方法提取胎兒游離DNA，構(gòu)建文庫，上機(jī)，產(chǎn)出的原始測序數(shù)據(jù)量約為NIPT的5倍。下機(jī)后運用RUPA算法進(jìn)行序列比對并剔除含異常GC比例和低覆蓋率的測序數(shù)據(jù)，同時通過PCA分析方法提高信噪比以獲取準(zhǔn)確的測序數(shù)據(jù)。評判規(guī)則同上。

1.2.3 隨訪方法：對檢測結(jié)果提示高風(fēng)險者，召回并進(jìn)行遺傳咨詢，告知侵入性產(chǎn)前診斷風(fēng)險，簽署知情同意書。在超聲指引定位下無菌操作環(huán)境中行經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù)，抽取20 mL羊水，進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片、G顯帶。根據(jù)人類國際細(xì)胞遺傳學(xué)命名體系（ISCN2016）進(jìn)行核型計數(shù)和分析。

2 結(jié)果

2.1 NIPT普通三項對SCAs的檢測結(jié)果 15 218例孕婦中NIPT普通三項提示SCAs高風(fēng)險125例，篩查陽性率為0.82%（125/15 218）。性染色體數(shù)目減少（45, X）55例，性染色體數(shù)目增多70例，其中超雌綜合征（47, XXX）36例，克氏綜合征（47, XXY）27例，超雄綜合征（47, XYY）7例。

2.2 NIPT普通三項檢測結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果比較 NIPT普通三項提示125例SCAs高風(fēng)險，其中僅70例選擇在我院行羊水穿刺。經(jīng)染色體核型分析，有17例被確診為胎兒患有不同類型的SCAs，陽性預(yù)測值為24.29%（17/70），見圖1。NIPT普通三項提示性染色體數(shù)目減少（45, X）的55例中，34例選擇羊水穿刺，染色體核型結(jié)果符合4例，陽性預(yù)測值11.76%（4/34）。NIPT普通三項提示性染色體數(shù)目增多的70例中，36例選擇羊水穿刺，染色體核型結(jié)果符合13例，陽性預(yù)測值36.11%（13/36），其中（47,XXX）、 （47, XXY）和（47, XYY）的陽性預(yù)測值分別為22.22%（4/18）、46.67%（7/15）、66.67%（2/3）。見表1。

圖1 NIPT普通三項提示SCAs高風(fēng)險者的羊水核型圖

表1 NIPT普通三項對胎兒SCAs篩查的效能分析

2.3 NIPT PLUS對SCAs的檢測結(jié)果 11 948例孕婦中NIPT PLUS提示SCAs高風(fēng)險97例，篩查陽性率為0.81%（97/11 948）。性染色體數(shù)目減少（45, X）41例，性染色體數(shù)目增多56例，其中超雌綜合征（47, XXX）22例，克氏綜合征（47, XXY）28例，超雄綜合征（47,XYY）6例。

2.4 NIPT PLUS檢測結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果比較 NIPT PLUS提示97例SCAs高風(fēng)險，其中70例選擇在我院行羊水穿刺。經(jīng)染色體核型分析，有29例被確診為胎兒患有不同類型的SCAs，陽性預(yù)測值為41.43%（29/70），見圖2。NIPT PLUS提示性染色體數(shù)目減少（45, X）的41例中，29例選擇羊水穿刺，染色體核型結(jié)果符合5例，陽性預(yù)測值17.24%（5/29）。NIPT PLUS提示性染色體數(shù)目增多的56例中，41例選擇羊水穿刺，染色體核型結(jié)果異常24例，陽性預(yù)測值58.54%（24/41），其中（47, XXX）、 （47,XXY）和（47, XYY）的陽性預(yù)測值分別為52.94%（9/17）、 60.00%（12/20）、75.00%（3/4）。見表2。

表2 NIPT PLUS對胎兒SCAs篩查的效能分析

圖2 NIPT PLUS提示SCAs高風(fēng)險者的羊水核型圖

3 討論

跟常規(guī)的產(chǎn)前篩查相比，NIPT具有更高的敏感度和特異度，對于常見的21-三體、18-三體、13-三體的陽性預(yù)測值較高，尤其是21-三體的陽性預(yù)測值高達(dá)95%。染色體核型分析因其高準(zhǔn)確性等優(yōu)點成為染色體非整倍體產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但胎兒細(xì)胞的獲得手段均為有創(chuàng)穿刺，存在宮內(nèi)感染、早產(chǎn)、流產(chǎn)等風(fēng)險，難以普及。自NIPT應(yīng)用于臨床以來，大大減少了侵入性產(chǎn)前診斷的數(shù)量。一項回顧性研究顯示，該醫(yī)院自2012年應(yīng)用NIPT之后，羊膜穿刺術(shù)減少了76%，絨毛穿刺術(shù)減少了54%[8]。

回顧近年關(guān)于NIPT篩查SCAs的研究，發(fā)現(xiàn)其檢測準(zhǔn)確性具有較大差異，陽性率為0.31%～0.65%，陽性預(yù)測值為30%～80%[9-11，13-17]。MARGIOTTI等[11]對9 985 例孕婦進(jìn)行NIPT檢測分析得出SCAs總體陽性預(yù)測值為77.27%（17/22）， （45, X）陽性預(yù)測值為69.23%， （47, XXX）陽性預(yù)測值為100%， （47,XXY）陽性預(yù)測值為80%， （47, XYY）陽性預(yù)測值為100%。SONG等[12]研究中SCAs篩查的陽性預(yù)測值為54.55%（24/44）， （45, X）的陽性預(yù)測值為23.53%（4/17）， （47, XXX）、 （47, XXY）和（47, XYY）的陽性預(yù)測值分別為70%、75%和80%。SUO等[13]研究中SCAs陽性預(yù)測值為46.88%，（45, X）的陽性預(yù)測值為32.43%， （47, XXX）、 （47, XXY）、 （47, XYY）的陽性預(yù)測值分別為55.56%、60%、87.5%。

在本研究15 218例行NIPT普通三項的單胎孕婦中，SCAs高風(fēng)險者125例，陽性率為0.82%，總體陽性預(yù)測值為24.29%。2017年中旬開始我院試運行NIPT PLUS。與傳統(tǒng)NIPT相比，NIPT PLUS在實驗技術(shù)和數(shù)據(jù)分析上均做了相應(yīng)改進(jìn)，以期提高NIPT的檢出效能。對11 948例單胎妊娠孕婦行NIPT PLUS檢測分析得出SCAs陽性率為0.81%，總體陽性預(yù)測值為41.43%。兩者SCAs陽性率基本一致，對性染色體數(shù)目增多的陽性預(yù)測值（NIPT普通三項：36.11%；NIPT PLUS：58.54%）高于性染色體數(shù)目減少者（NIPT普通三項：11.76%；NIPT PLUS：17.24%），與文獻(xiàn)[18-19]報道類似。NIPT或NIPT PLUS對包含Y染色體的SCAs的檢測效能更高，但對（45, X）的檢測準(zhǔn)確性還有待提高。與NIPT普通三項相比，NIPT PLUS大大提高了SCAs總體陽性預(yù)測值，且各類SCAs的陽性預(yù)測值均有提高，但仍存在較高的假陽性。對NIPT或NIPT PLUS結(jié)果提示低風(fēng)險者進(jìn)行電話隨訪，暫未發(fā)現(xiàn)SCAs患兒。目前鮮少有文獻(xiàn)談及NIPT的SCAs陰性預(yù)測值。在采用高通量測序?qū)?70例孕婦進(jìn)行SCAs篩查的研究中，陰性預(yù)測值為100%[20]。LIANG等[7]對412例孕婦進(jìn)行NIPT檢測的研究也提示SCAs陰性預(yù)測值為100%。鑒于此疾病臨床異質(zhì)性強，社會及群眾認(rèn)知不足，但仍無法排除假陰性的可能。關(guān)于造成NIPT結(jié)果與核型結(jié)果不符的原因可能與以下因素相關(guān)[3，21]：①X染色體的胸腺嘧啶和胞嘧啶的偏移及鳥嘌呤和胞嘧啶的測序偏差；②Y染色體跟其他染色體有較多相似片段，降低了測序信噪比；③胎兒游離DNA比例過高或過低；④胎兒嵌合體；⑤胎兒性染色體結(jié)構(gòu)異常；⑥母體染色體核型異常，包括未知的母體嵌合體和拷貝數(shù)異常；⑦母源性腫瘤；⑧局限性胎盤嵌合（confined placental mosaicism,CPM）等。近30%的NIPT假陰性或假陽性是由CPM造成的，約1%的妊娠會發(fā)生CPM，且X染色體單體的CPM多發(fā)，那么針對SCAs篩查，NIPT的假陰性或假陽性是無法避免的。

關(guān)于該項技術(shù)在SCAs上的應(yīng)用問題，美國醫(yī)學(xué)遺傳與基因組學(xué)會曾在2016年發(fā)表聲明指出，應(yīng)告知孕婦NIPT可用于SCAs篩查，但其假陽性較高[22]。

綜上，NIPT可做為SCAs產(chǎn)前篩查方法，具有較高的臨床應(yīng)用價值，但其檢測效能仍有待提高。在檢測前應(yīng)充分告知該項技術(shù)的優(yōu)勢和局限性，對于高風(fēng)險病例需進(jìn)一步產(chǎn)前診斷，對于低風(fēng)險病例要警惕漏診可能。由于SCAs患者可能無明顯表型，確診者均應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的遺傳咨詢，慎重考慮胎兒的去留。