摘要：為探討三黃瀉心湯中生物堿在體內(nèi)不同酸堿環(huán)境下的溶出量，采用半仿生和溴甲酚綠酸性染料比色法測(cè)定三黃瀉心湯2種炮制法中總生物堿的含量。結(jié)果表明，半仿生-酸性染料比色法用于復(fù)方制劑三黃瀉心湯中總生物堿測(cè)定的方法可行，線性良好、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、回收率較高;三黃瀉心湯煎煮劑中總生物堿溶出量高于浸制劑，pH為1.2～6.8時(shí)，溶出量先降低再升高后逐漸減低，呈現(xiàn)出開口向上的拋物曲線型，總體上，酸性增強(qiáng)利于總生物堿的溶出。

關(guān)鍵詞：酸性染料比色法;半仿生法;三黃瀉心湯;總生物堿

中圖分類號(hào)：R284 " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2022）03-0140-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2022.03.028 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of total alkaloids dissolving amount in Sanhuang Xiexin Decoction

by semi-bionic colorimetric method

YU Jia，GAO Xin-yue，F(xiàn)U Feng-ping，WU Jian-ying，YU Lin， CHEN Hong-ying

（College of Life Sciences and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang "621010，Sichuan，China）

Abstract：In order to investigate the amount of alkaloids dissolved in Sanhuang Xiexin Decoction under different acid-base conditions， the contents of total alkaloids in Sanhuang Xiexin Decoction were determined by semi-bionic colorimetric method and bromocresol green acid dye colorimetry. The results showed that the semi-bionic acid dye colorimetric method was feasible for the determination of total alkaloids in Sanhuang Xiexin Decoction， with good linearity， specificity， repeatability and high recovery. The amount of total alkaloids dissolved in Sanhuang Xiexin Decoction was higher than that in the dipping preparation. When the pH was 1.2～6.8，the amount of total alkaloids dissolved first decreased， then increased， and then gradually decreased， presenting a parabolic curve with upward opening. In general， the increase of acidity was conducive to the dissolution of total alkaloids.

Key words： acid dye colorimetry method; semi-bionic method; Sanhuang Xiexin Decoction; total alkaloids

三黃瀉心湯是張仲景的經(jīng)典復(fù)方制劑，適用于邪火內(nèi)熾、瘀熱內(nèi)積等癥，有清熱瀉火解毒、化瘀涼血止血之效[1]。該制劑出自《金匱要略》，方中大黃100 g，黃連50 g，黃芩50 g，以水3 L煮取1 L，頓服之。又有《傷寒論》中，“心下痞，按之濡，其脈關(guān)上浮者，大黃黃連瀉心湯主之。大黃100 g，黃連50 g，右2味，以麻沸湯漬之，須臾，絞去滓，分溫再服”[2]?？梢?，古方中三黃瀉心湯有煎煮法和浸制法2種炮制方法。

藥物經(jīng)口服產(chǎn)生藥效，需要經(jīng)過溶解、滲透等過程。中藥湯劑臨床上通常為懸浮液，在體內(nèi)酸堿環(huán)境下，懸浮液中的沉淀可能溶解或產(chǎn)生新的沉淀。三黃瀉心湯中有效成分主要為生物堿（來自黃連）、黃酮（來自黃芩）和蒽醌類（來自大黃），其中生物堿具有抗腫瘤、抑制心血管和胃腸道疾病、抗炎等作用[3]。瀉心湯中入血成分主要來自蒽醌類和黃酮類化合物，而黃連中的生物堿成分入血含量很低，相關(guān)研究認(rèn)為黃連中的生物堿成分可能先在胃腸道的酸堿環(huán)境和菌群作用下發(fā)生代謝，再到達(dá)相應(yīng)的作用靶點(diǎn)[4，5]。為了解2種不同炮制方法制備的瀉心湯中生物堿成分在胃腸道環(huán)境下的溶解情況，試驗(yàn)采用半仿生結(jié)合酸性染料比色法對(duì)2種瀉心湯中總生物堿含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃連、黃芩、大黃均購于四川綿陽太極大藥房，經(jīng)西南科技大學(xué)盧學(xué)琴老師鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》（2020年版）規(guī)定。對(duì)照品鹽酸小檗堿、大黃酸、黃芩苷均購自上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度gt;99.9%，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），510型pH計(jì)（上海訊輝環(huán)?？萍加邢薰荆?，TP-213型天平（北京丹佛儀器有限公司），RE 52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、B-220型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠），SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），HNY-2102C振蕩培養(yǎng)箱（上海百典儀器設(shè)備公司）。

1.3 方法與步驟

1.3.1 瀉心湯的制備 中藥材處理：3種中藥材在60 ℃烘箱中烘干，粉碎，過60目篩。

三黃瀉心湯煎煮液（DSXT）：精密稱取10.04 g大黃、5.02 g黃芩、5.09 g黃連，加入10倍量水，浸泡15 min后，微沸煎煮1 h后用4層紗布過濾。濾渣中加入6倍量水，同法操作，合并2次濾液濃縮至 " "500 mL。置于4 ℃保存。

三黃瀉心湯浸制液（MSXT）：精密稱取10.06 g大黃、5.10 g黃芩、5.07 g黃連，加入200 mL沸水，浸泡48 min（加保鮮膜），4層紗布過濾。濾渣分2次加入100 mL沸水，浸泡30 min。合并3次濾液，減壓濃縮至500 mL。置于4 ℃保存。

1.3.2 半仿生法提取 三黃瀉心湯煎煮液和浸制液分別留取一部分，作為樣品對(duì)照液（pH分別為3.5、3.3）。取瀉心湯煎煮液和浸制液適量，根據(jù)人體胃腸液的酸堿度情況（胃液pH為0.9～1.2，小腸液pH為5～7），利用2 mol/L鹽酸溶液或2 mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH為1.2、2.4、4.5、5.5、6.8，用以模擬人體消化系統(tǒng)pH環(huán)境。然后放置于37 ℃恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速100 r/min，保溫2 h，離心5 min，留取上清液待測(cè)。

1.3.3 總生物堿的溶出量測(cè)定

1）溶液的配制。枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 4.0）：枸櫞酸 2.1 g加水溶解成100 mL，冰箱保存為甲液;磷酸氫二鈉 7.163 g加水溶解成100 mL，保存為乙液。取61.45 mL的甲液和38.55 mL的乙液混合，搖勻，pH計(jì)調(diào)節(jié)為4.0。

溴甲酚綠溶液（0.05%）：精密稱取溴甲酚綠0.05 g，加入枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解成 " "100 mL。

2）對(duì)照品溶液的制備。分別精密稱取干燥至恒重的鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃酸對(duì)照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加入枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解，并稀釋至刻度。

3）供試品溶液的制備。量取“1.3.2”溶液2 mL，減壓蒸餾至干后用枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解并定容至25 mL。

1.3.4 含量測(cè)定

1）測(cè)定波長的選擇。準(zhǔn)確量取0.5 mL各樣品溶液和3種對(duì)照品溶液，依次加入枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液至2 mL。加入溴草酚綠溶液1.5 mL，氯仿10 mL，振搖3 min，靜止0.5 h后分取氯仿液，使用分光光度計(jì)進(jìn)行波長掃描。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取對(duì)照品溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，按照以上測(cè)定方法在417 nm處測(cè)定其吸光度。

3）樣品測(cè)定。分別吸取樣品溶液0.5 mL，加pH 4.0枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液至2 mL。加入溴草酚綠溶液1.5 mL，氯仿10 mL，振搖3 min，靜止0.5 h后分取氯仿液，在417 nm處測(cè)定其吸收度。

1.3.5 薄層色譜法測(cè)定萃取溶液試驗(yàn) 每個(gè)樣品各吸取10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-氨水（5︰1︰0.1）為展開劑，預(yù)飽和20 min，展開，取出，晾干。在紫外分析儀365 nm處觀察熒光斑點(diǎn)。

1.3.6 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取MSXT、DSXT組樣品原液0.5 mL，按照“1.3.4”的測(cè)定方法進(jìn)行樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)，每間隔0.5 h，在417 nm下測(cè)定吸收度。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取5份，每份大黃1 g，黃連0.5 g，黃芩0.5 g，按照MSXT、DSXT組樣品制備方法制備，依“1.3.4”測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，在417 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.8 回收率試驗(yàn) 吸取MSXT、DSXT組樣品原液0.2 mL 3份，分別加入對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3 mL，依“1.3.4”測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長的確定

由圖1可知，各樣品液和小檗堿對(duì)照溶液在417 nm處均有相同的穩(wěn)定吸收峰，空白液、大黃酸和黃芩苷對(duì)照溶液在此處無吸收峰，與文獻(xiàn)[4]報(bào)道一致。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖2可以得出，吸光度與對(duì)照品濃度間的函數(shù)關(guān)系為y = 4.45x，其中R2 = 0.991 6。

2.3 薄層色譜法測(cè)定萃取溶液試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可以得出，在與對(duì)照品和藥材色譜相應(yīng)的位置上，萃取下層液有顯相同顏色的主斑點(diǎn)，而萃取下層液相同位置高度處，無相似的熒光斑點(diǎn)。說明在試驗(yàn)條件下，生物堿與酸性染料溴甲酚綠生成離子對(duì)后，基本上被完全萃取在下層三氯甲烷溶液中。

2.4 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

在417 nm下測(cè)定樣品溶液的吸光度，得到MSXT組樣品RSD=1.554%，n=5;DSXT樣品RSD=1.826%，n=5，表明2種瀉心湯樣品在2 h內(nèi)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

在417 nm處測(cè)定樣品溶液的吸光度，得到MSXT組樣品RSD為0.32%，n=4;DSXT組樣品RSD為0.49%，n=4，表明兩種瀉心湯樣品重復(fù)性均良好。

2.6 回收率試驗(yàn)結(jié)果

在417 nm處測(cè)定樣品溶液的吸光度，得到MSXT組樣品回收率分別為99.0%，99.7%，98.3%，平均回收率為99.0%;DSXT組樣品回收率分別為99.3%，99.5%，98.7%，平均回收率為99.17%，表明兩種瀉心湯樣品回收率均良好。

2.7 三黃瀉心湯總生物堿測(cè)定方法的確定

三黃瀉心湯是一種復(fù)方制劑，有黃酮類、蒽醌類、生物堿類等多種成分存在。劉晶晶等[6]用HPLC梯度洗脫法測(cè)定該方劑中5種主要生物堿（鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸表小檗堿、鹽酸藥根堿）的含量。該試驗(yàn)采用酸性染料比色法測(cè)定該復(fù)方制劑中總生物堿的含量，結(jié)果顯示，黃酮類化合物黃芩苷和蒽醌類成分大黃酸在此測(cè)定波長對(duì)生物堿的測(cè)定無干擾，表明該方法專屬性較強(qiáng)，穩(wěn)定性良好，重復(fù)性良好，回收率較高，說明該方法可行。酸性染料溴甲酚綠優(yōu)先選擇與其中的生物堿類成分結(jié)合生成離子對(duì)化合物，再利用三氯甲烷將離子對(duì)化合物完全萃取出。

2.8 樣品總生物堿

將樣品液按照“1.3.4”項(xiàng)測(cè)定方法進(jìn)行，在417 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三黃瀉心湯中總生物堿的含量，結(jié)果如下（表1）。

試驗(yàn)結(jié)果說明，①在相同pH條件下，DSXT組樣品總生物堿含量高于MSXT組樣品總生物堿含量，即煎煮法比浸制法更能使三黃瀉心湯的生物堿成分溶出，這與已有的報(bào)道[7]總體趨勢(shì)基本一致;②同一劑型中，先隨著pH的增大（從1.2到4.5，原液pH約3.4），生物堿的含量逐漸減小，在pH為5.5時(shí)增大，隨后生物堿含量有降低的趨勢(shì)，其中pH為1.2時(shí)，總生物堿含量在指定試驗(yàn)條件內(nèi)為最大值，這與生物堿本身是一種弱堿，在人體胃部的弱酸性環(huán)境利于生物堿的溶出相關(guān)。由此推測(cè)，三黃瀉心湯中總生物堿的含量隨酸堿度環(huán)境不同而有所改變，原液為混懸液，其中的絮狀物或結(jié)合物可能會(huì)溶出，或者在不同環(huán)境，又產(chǎn)生新的沉淀;生物堿在胃中的含量最高，隨后逐漸減小，經(jīng)過十二指腸時(shí)，生物堿含量又逐漸增大，隨后再逐漸降低。馮有龍等[8]用LC/MS2法，測(cè)定該方劑煎煮液與其中沉淀物有相似的化學(xué)組成，其中小檗堿、巴馬汀和藥根堿3種生物堿在人工胃液中的含量均大于人工腸液。說明方劑炮制后，煎煮或浸制后的懸浮液更接近中藥的本質(zhì)，混懸液中的沉淀也是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的一部分，應(yīng)以懸浮液作為一個(gè)整體進(jìn)行考慮，不可隨意丟棄。

黃連在方劑中起臣藥的作用，其中的生物堿成分為三黃瀉心湯中藥效組分之一，總生物堿含量的改變會(huì)影響方劑中君藥蒽醌類成分。有研究[9]認(rèn)為方劑中生物堿明顯減少游離蒽醌的生物利用度，但黃芩的加入弱化了它們之間的這種作用。至于生物堿在方劑中的作用，相關(guān)研究報(bào)道方劑中黃連幾種生物堿（小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿）入血成分很少，估計(jì)生物堿成分受胃腸道菌群的影響，可能通過其他途徑產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物而起到相應(yīng)的預(yù)防和治療的作用[3-5]。

3 小結(jié)

采用半仿生法提取，三黃瀉心湯中總生物堿在試驗(yàn)條件下測(cè)定，pH為1.2時(shí)，溶出量為試驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)的最大值，并且煎煮劑的生物堿溶出量在總體趨勢(shì)上大于浸制劑的生物堿溶出量;隨著pH的增大，溶解的生物堿含量逐漸減小，pH為5.5（十二指腸模擬環(huán)境）時(shí)出現(xiàn)小幅增大，后呈現(xiàn)逐漸減小的狀態(tài)。說明酸性環(huán)境（模擬胃液條件）下，生物堿更易溶出;三黃瀉心湯煎劑比浸制劑更利于生物堿的溶出。

采用半仿生-酸性染料比色法進(jìn)行復(fù)方制劑三黃瀉心湯中總生物堿含量的測(cè)定，黃酮類化合物和蒽醌類化合物干擾較小，專屬性強(qiáng)，線性良好，方法穩(wěn)定，準(zhǔn)確度和重復(fù)性較高，方法簡(jiǎn)單，能快速了解復(fù)方制劑三黃瀉心湯中總生物堿的溶出情況，對(duì)三黃瀉心湯的劑型開發(fā)和體外模擬試驗(yàn)有一定的參考意義。

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