摘要：對(duì)細(xì)圓藤（Pericampylus glaucus）醇提取物的急性毒性進(jìn)行初步研究，篩選出細(xì)圓藤抗炎、鎮(zhèn)痛有效部位，為新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。采用最大給藥量測(cè)定法，小鼠灌胃給藥測(cè)定藤水提取物和醇提物的半數(shù)致死量（LD50）或最大耐受量（MTD）研究其安全性;采用冰醋酸致小鼠疼痛和小鼠熱刺激反應(yīng)考察細(xì)圓藤不同提取部位的鎮(zhèn)痛作用;采用瓊脂肉芽腫脹法觀察細(xì)圓藤不同提取部位的抗炎作用。結(jié)果顯示，在急性毒性中，未測(cè)得半數(shù)致死量LD50，細(xì)圓藤醇提取物的 MTDgt;94 g/kg，最大耐受量倍數(shù)相當(dāng)成人（60 kg）用量的376倍;細(xì)圓藤不同部位組均能減輕小鼠肉芽濕重，細(xì)圓藤石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的抑制率分別為13.74%、21.35%、16.35%、32.27%，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與空白對(duì)照組比較，細(xì)圓藤石油醚部位、水部位在給藥后90、120 min痛閾值顯著提高;細(xì)圓藤乙酸乙酯部位、正丁醇部位在給藥后120 min痛閾值顯著提高，細(xì)圓藤不同部位組均能減輕醋酸引起小鼠疼痛，其中細(xì)圓藤石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的鎮(zhèn)痛率分別為51.74%、37.63%、32.13%、40.55%，與空白組比較其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)圓藤無(wú)明顯毒性，臨床常用量安全可行;在抗炎鎮(zhèn)痛有效部位篩選發(fā)現(xiàn)，細(xì)圓藤不同部位均具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用，細(xì)圓藤石油醚部位鎮(zhèn)痛效果最強(qiáng)，水部位抗炎效果最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：細(xì)圓藤（Pericampylus glaucus）;急性毒性試驗(yàn);最大耐受量（MTD）;抗炎鎮(zhèn)痛;有效部位

中圖分類號(hào)：R291.5 " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2022）03-0096-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2022.03.018 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on acute toxicity of ethanol extract of Pericampylus glaucus and screening of effective anti-inflammatory and analgesic components

LIU Wen-jun1，2，LI Jin-zhou3，CHEN Zi-jun1， QIN Chun-mei1，ZHOU Meng-ying1，CHEN Yong1

（1.Scientific Experiment Center of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning "530200，China;2. Shenzhen "Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Shenzhen "518100， Guangdong，China;3.Guilin People’s Hospital， Guilin "541002， Guangxi，China）

Abstract： To study the acute toxicity of alcohol extract of Pericampylus glaucus，the effective anti-inflammatory and analgesic parts of Pericampylus glaucus were screened out to provide theoretical basis for the development of new drugs. The maximum dose assay was used to determine the safety of the water extract and alcohol extract by intragastric administration. The analgesic effects of different extract parts of Pericampylus glaucus were investigated by glacial acetic acid-induced pain in mice and thermal stimulation in mice. The anti-inflammatory effects of different extract parts of Pericampylus glaucus were observed by AGAR granulomatous method. The results showed that in acute toxicity， the lethal dose （LD50） was not measured， the MTD of the alcohol extract was more than 94 g/kg， and the maximum tolerance was 376 times of the adult dosage （60 kg）. The inhibition rates of petroleum ether， ethyl acetate， n-butanol and water were 13.74%， 21.35%， 16.35% and 32.27%， respectively， with statistical significance. Compared with blank control group， the pain threshold of petroleum ether and water parts was significantly increased 90 and 120 min after administration. The pain threshold of ethyl acetate part and n-butanol part of Pericampylus glaucus significantly increased 120 min after administration， and different parts of Pericampylus glaucus could relieve the pain caused by acetic acid in mice. The analgesic rates of petroleum ether part， ethyl acetate part， N-butanol part and water part were 51.74%， 37.63%， 32.13% and 40.55%， respectively. Compared with blank group， the difference was statistically significant. There was no obvious toxicity， and the usual clinical dosage was safe and feasible. "In the screening of effective anti-inflammatory and analgesic parts， it was found that the different parts of Pericampylus glaucus had certain anti-inflammatory and analgesic effects， the oil ether part of Pericampylus glaucus had the strongest analgesic effect， and the water part had the strongest anti-inflammatory effect.

Key words： Pericampylus glaucus; acute toxicity experiment; maximum tolerated dose（MTD）; anti-inflammatory and analgesic; valid target

細(xì)圓藤[Pericampylus glaucus（Lam.）Merr.]為防已科細(xì)圓藤屬植物，又名為廣藤、車線藤、土藤等，全株均可入藥。其藤部味苦，性涼，有祛風(fēng)鎮(zhèn)靜的功能，民間用來(lái)治療小兒驚風(fēng)、破傷風(fēng)。根部為喉科藥，可止咳，又能治毒蛇咬傷、瘡癤等[1]。近年來(lái)，有學(xué)者研究細(xì)圓藤的化學(xué)成分，分析發(fā)現(xiàn)其含有綠原酸、千金藤啶堿、表木栓醇、蜂蜜酸、棕櫚酸、硬指酸、白樺脂酸及胡蘿卜甙[2，3]。且從細(xì)圓藤中分離出的某種脂肪酸類化合物對(duì)人體慢性髓性白血病K562細(xì)胞增值有一定的抑制作用[4]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)細(xì)圓藤的研究主要集中于葉子，并發(fā)現(xiàn)葉子具有抗腫瘤、抗鼻咽癌、抗炎、抗HIV、解熱鎮(zhèn)痛等藥理作用[5-8]，但未見報(bào)道細(xì)圓藤的醇提物急性毒性試驗(yàn)。本研究對(duì)細(xì)圓藤的醇提物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，得出細(xì)圓藤的安全范圍，為其臨床用藥提供參考，對(duì)其抗炎鎮(zhèn)痛的有效部位進(jìn)行篩選，也為進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

76電子天平（EL204，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S2，金壇市醫(yī)療儀器廠）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA 型，上海亞榮生化儀器廠）;智能熱板鎮(zhèn)痛儀（成都泰盟軟件有限公司）。

1.2 主要藥材與試劑

細(xì)圓藤藥材采于廣西壯族自治區(qū)欽州縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)陸海琳副教授鑒定為防已科細(xì)圓藤屬植物細(xì)圓藤的地上部分（藤和葉子）。瓊脂（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)731U022）;冰醋酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160606）;醋酸地塞米松片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)191030201）;羅通定片（四川迪菲特藥業(yè)有限公司，批號(hào)190402）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明種（KM）小鼠，體量18～22 g，雌雄兼用，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠雌雄分開飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和每只攝食3 g，除灌胃及觀察時(shí)間外，其余時(shí)間均為動(dòng)物照明。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)圓藤醇提物不同部位的制備

1）細(xì)圓藤醇提物的制備。稱取細(xì)圓藤粗粉2.7 kg，加10倍量75%乙醇，回流提取3 次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無(wú)醇。冷凍干燥得細(xì)圓藤醇提物227.06 g。取細(xì)圓藤醇提物適量，去離子水配成每毫升含2.35 g 生藥的溶液，置冰箱備用。

2）細(xì)圓藤不同部位的制備。取細(xì)圓藤乙醇提取物浸膏275 g，用溫水超聲溶解，依次用等倍量的石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取，分別得到石油醚浸膏（9.462 g）、乙酸乙酯部位浸膏（50.319 g）、正丁醇部位浸膏（72.174 g）、水部位浸膏（72.319 g），灌胃前根據(jù)其急毒試驗(yàn)，按照臨床用量的20倍分別用水配制成相同濃度的溶液（膏重/體重）。

1.4.2 半數(shù)致死量（LD50）試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[9]，選取體重18～22 g的SPF級(jí)KM小鼠70只，雌雄各占50%，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，按體重隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組、細(xì)圓藤醇提取物高、中、低劑量組。分別以細(xì)圓藤醇提物可給灌胃的最大混懸濃度2.35 g/mL（每毫升含2.35 g生藥）為起始濃度，按1∶10遞減，即細(xì)圓藤醇提取物以2.350 0、0.235 0、0.023 5 g/mL的藥物濃度進(jìn)行灌胃。上述各給藥組均按小鼠最大給藥體積40 mL/kg灌胃1次，空白對(duì)照組給予等體積去離子水灌胃。給藥前禁食不禁水12 h，給藥4 h后正常喂養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d。找出各組零致死量Dn和全致死量Dm進(jìn)行LD50值測(cè)定。如果試驗(yàn)無(wú)法測(cè)出細(xì)圓藤水提取物和醇提取物的半數(shù)致死量，則進(jìn)行最大給藥量試驗(yàn)。

1.4.3 最大給藥量試驗(yàn) 取KM小鼠60只，雌雄各占50%，按體重隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組、細(xì)圓藤水提取物組和醇提物組。給藥組分別按照細(xì)圓藤水提物和醇提取物可供灌胃的最大混懸濃度2.35 g/mL，最大給藥體積40 mL/kg體重灌胃，空白對(duì)照組按同樣給藥方法用去離子水灌胃。1 d內(nèi)灌胃給藥1次，試驗(yàn)小鼠給藥4 h后，按常規(guī)飼養(yǎng)（每天固定飼料喂養(yǎng)1次），連續(xù)觀察14 d。期間觀察并記錄小鼠飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)、皮毛膚色和大小便等，觀察有無(wú)中毒癥狀及死亡現(xiàn)象出現(xiàn)。第14天時(shí)，處死全部小鼠，解離出心、肝、脾、肺、腎，觀察有無(wú)病變情況，并對(duì)其稱重，計(jì)算其臟器系數(shù)，臟器系數(shù)= 臟器質(zhì)量（mg）/體重（g）。

小鼠的最大給藥量倍數(shù)=（每只小鼠最大給藥量/小鼠平均體重）×（成人平均體重/成人每日用量）

（1）

1.4.4 細(xì)圓藤鎮(zhèn)痛活性部位的篩選

1）熱板法。參考文獻(xiàn)[10]，取用KM種小鼠，雌性，體重18～22 g，進(jìn)行熱板試驗(yàn)。將小鼠置于（55±0.5） ℃的熱板儀上，記錄各組小鼠足底接觸熱板至出現(xiàn)舔后足（潛伏期）作為痛閾指標(biāo)，凡30 s內(nèi)仍不出現(xiàn)舔足者棄之不用，挑選痛閾在5～30 s內(nèi)的小鼠72只用于試驗(yàn)。將之前篩選痛閾合格的60只KM種小鼠隨機(jī)分為空白組（去離子水）和陽(yáng)性對(duì)照組（羅痛定0.074 g/kg）、細(xì)圓藤石油醚部位（0.235 g/kg）、細(xì)圓藤乙酸乙酯部位（1.240 g/kg）、細(xì)圓藤正丁醇部位（1.784 g/kg）、細(xì)圓藤水部位（1.785 g/kg）共6個(gè)組，灌胃（ig）給藥，每天1次，連續(xù)7 d，末次ig給藥后30、60、90、120 min各重復(fù)測(cè)定舔足潛伏期，記錄痛閾值，比較給藥前后痛閾的變化，痛閾值提高百分率=[（用藥后平均痛閾值-用藥前平均痛閾值）/用藥前平均痛閾值]×100%。

2）小鼠醋酸扭體試驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[11]，將72只KM種小鼠隨機(jī)分組，分組同“1.4.4”中的熱板法，每組12只，灌胃（ig）給藥，每天給藥1次，連續(xù)7 d，第7 天給藥60 min 后腹腔給予0.6%冰醋酸溶液（10 mL/kg），記錄15 min 內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，并按下列公式計(jì)算細(xì)圓藤的鎮(zhèn)痛能力（抑制率）。

鎮(zhèn)痛能力（抑制率）=[（對(duì)照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）/對(duì)照組扭體次數(shù)]×100% "（2）

1.4.5 瓊脂肉芽致小鼠炎癥試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[12]，取KM小鼠72只，隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為模型組、地塞米松組（50 mg/kg）及細(xì)圓藤不同部位（分組同“1.4.4”中的熱板法）。所有小鼠均在背部皮下注射2 %瓊脂，每只0.3 mL，給藥組于第2天開始灌胃（ig）給藥，每天1次，連續(xù)7 d，模型組給予等量去離子水，第8天將小鼠脫頸椎處死，剝離瓊脂肉芽塊，并稱濕重，計(jì)算腫脹抑制率，抑制率=[（模型組瓊脂肉芽重量-給藥組瓊脂肉芽重量）/模型組瓊脂肉芽重量]×100%。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 半數(shù)致死量試驗(yàn)結(jié)果

小鼠分別灌服細(xì)圓藤水提取物和醇提取物后連續(xù)觀察14 d，小鼠均未死亡。給藥后的4 h內(nèi)觀察小鼠的呼吸功能、排泄物、精神狀態(tài)及行為狀態(tài)均未見明顯異常，后續(xù)觀察也未見異常。因此，改為測(cè)定小鼠最大耐受量（MTD）來(lái)判斷細(xì)圓藤水提液和醇提物對(duì)小鼠的急性毒性作用，結(jié)果見表1。

2.2 最大給藥量試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)毒性癥狀觀察可知，進(jìn)行試驗(yàn)的60只小鼠全部存活，絕大部分小鼠解剖所見：胸腔、腹腔未見異常液體，腸道未見脹氣，心、肝、脾、肺、腎等主要器官形態(tài)質(zhì)地正常、未見顏色改變及其他病理改變，胃黏膜顏色正常，無(wú)出血點(diǎn)。根據(jù)《湖南藥物志》第一卷記載細(xì)圓藤日用量為9～15 g[13]，故以生藥量15 g作為成人（60 kg）的最大口服日用量。按照最大耐受量倍數(shù)公式[14]計(jì)算，細(xì)圓藤醇提物的最大耐受量 " "gt;94 g/kg，該藥材臨床常用量在9～15 g，本試驗(yàn)小鼠用量相當(dāng)于成人（60 kg）用量的376倍。且細(xì)圓藤醇提物2組小鼠中雌鼠及雄鼠的心、肝、脾、肺、腎的體重比值及體重增長(zhǎng)與空白組比較均無(wú)顯著差異 ，試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3、表4。

2.3 細(xì)圓藤醇提物不同部位抗炎鎮(zhèn)痛結(jié)果

2.3.1 細(xì)圓藤醇提物不同部位提取部位對(duì)熱板致痛閾值的影響 細(xì)圓藤醇提物不同部位提取物組小鼠的舔足時(shí)間均有所延長(zhǎng)，其中與空白對(duì)照組相比，細(xì)圓藤石油醚部位、水部位在給藥后90、120 min痛閾值顯著提高（Plt;0.05，Plt;0.01）;細(xì)圓藤乙酸乙酯部位、正丁醇部位在給藥后120 min痛閾值顯著提高（Plt;0.001，Plt;0.05）。結(jié)果見表5。

2.3.2 細(xì)圓藤醇提物不同提取部位對(duì)小鼠醋酸扭體的影響 細(xì)圓藤醇提物不同部位組均能減輕醋酸引起小鼠疼痛，其中細(xì)圓藤醇提物石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的鎮(zhèn)痛率分別為51.74%、37.63%、32.13%、40.55%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）。結(jié)果見表6。

2.4 細(xì)圓藤醇提物不同提取部位對(duì)瓊脂肉芽腫的影響

模型組小鼠肉芽增生明顯，細(xì)圓藤醇提物不同部位組均能減輕小鼠肉芽濕重，細(xì)圓藤醇提物石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的抑制率分別為13.74%、21.35%、16.35%、32.27%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt; 0.01，Plt; 0.001）。結(jié)果見表7。

3 小結(jié)

本研究測(cè)得小鼠一次性口服細(xì)圓藤醇提物的最大耐受量為94 g原生藥/kg，該劑量為臨床擬用劑量（15.0 g/d即0.25 g原生藥/kg）的376倍，提示細(xì)圓藤醇提物臨床用藥是比較安全的，且通過(guò)瓊脂肉芽腫慢性炎癥模型比較細(xì)圓藤不同部位的抗炎效果，結(jié)果表明細(xì)圓藤水部位對(duì)小鼠肉芽的抑制作用最強(qiáng)，其次為乙酸乙酯部位;本研究中采用熱板法和醋酸扭體法篩選細(xì)圓藤鎮(zhèn)痛的有效部位，結(jié)果表明細(xì)圓藤不同提取部位均具有鎮(zhèn)痛效果，鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)為石油醚部位，其次為水部位。細(xì)圓藤抗炎鎮(zhèn)痛活性部位具體是通過(guò)哪種成分發(fā)揮作用及如何發(fā)揮其作用機(jī)制，還有待研究。

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