摘要：采用傳統(tǒng)的微生物富集、分離純化方法，對海岸水虱（Ligia exotica）消化道微生物進(jìn)行分離鑒定，得到1株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株，命名為HZL-3。利用分子生物學(xué)方法，初步確定其為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。采用ELISA法檢測HZL-3產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶含量，并研究溫度、pH、培養(yǎng)時間、接種量等因素對其產(chǎn)酶量的影響。結(jié)果表明，HZL-3能夠產(chǎn)生蛋白酶和淀粉酶;溫度36 ℃，pH為7.5，培養(yǎng)16 h，接種量為6%，蛋白酶活性最高;溫度36 ℃，pH為6.0，培養(yǎng)10 h，接種量為4%，淀粉酶活性最高，研究旨在揭示海岸水虱消化道微生物作為水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的潛在應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：海岸水虱（Ligia exotica）;凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）;分離鑒定;蛋白酶;淀粉酶

中圖分類號：Q939.9 " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2022）03-0078-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2022.03.015 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation and identification of Bacillus coagulans from the digestive tract of Ligia exotica and investigation of its enzyme production

ZHU Xin-ying1，SU Hong2，WANG Wei-bing3， XU Yong-zhong3， WANG Hong-bin1

（1. College of Marine Life and Fisheries Sciences， Jiangsu Ocean University， Lianyungang "222005， Jiangsu，China;

2. Xuzhou Aquarium，Xuzhou "222005，Jiangsu，China; 3. Suqian Dajiang Feed Co.，Ltd.， Suqian "223900， Jiangsu， China）

Abstract： In the experiment， a traditional method to enrich， separate and purify microorganisms was used in the digestive tract of Ligia exotica， and a strain with strong enzyme production ability was obtained and was named HZL-3 which was preliminarily determined as Bacillus coagulans by using molecular biological method. Contents of protease and amylase produced by HZL-3 was measured by ELISA and the effects of temperature， pH， culture time， inoculation amount and other factors on the amount of enzyme production were studied. The results showed that HZL-3 was able to produce protease and amylase; "when cultured for 16 h at 36 ℃， pH 7.5， and 6% inoculation amount， "protease activity was maximal; and amylase activity was the highest at 36 ℃， pH 6.0， when inoculation amount was 4%， and cultured for 10 h. This study aims to reveal the potential applications of microorganisms in the digestive tract of Ligia exotica as probiotics in aquaculture.

Key words： Ligia exotica; Bacillus coagulans; isolation and identification; protease; amylase

近年來，水產(chǎn)動物高密度養(yǎng)殖已成為現(xiàn)代養(yǎng)殖的主流模式，但也因此造成水產(chǎn)動物疾病的大量發(fā)生，人類活動的干預(yù)及抗生素的不當(dāng)使用使得水產(chǎn)動物體內(nèi)殘留大量藥物，通過食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重影響了人類身體健康[1-3]。由于抗生素的使用帶來了各種不良后果使其在水產(chǎn)品養(yǎng)殖與生產(chǎn)中逐漸被禁止使用，這就需要研發(fā)新的無毒副作用的替代品[3]。益生菌是最近發(fā)現(xiàn)并研究的熱點(diǎn)之一，益生菌制劑已經(jīng)被大量應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，給這一行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益[4]。益生菌不僅在水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)中被廣泛應(yīng)用，在其他方面也很重要，如生物防治、臨床醫(yī)學(xué)以及飼料添加等[4]。

海岸水虱（Ligia exotica）又名海蟑螂，俗稱海蛆，是一種廣泛分布的世界性物種，該種類群是等足目潮蟲亞目中個體最大、最原始的類群，生活于沿海潮間帶高潮淺巖石間或海灘邊的建筑物基部的縫隙中，有時也在中潮帶作急速的覓食活動，常藏于船艙內(nèi)，隨船漂游，身體水分流失的速度很快所以該種只能生活在海邊與湖邊這種高濕度的環(huán)境，食性為雜食性，喜歡藻類植物及海濱殘存的有機(jī)物碎屑，常作為海濱污染的指示生物，海岸水虱體內(nèi)具有抗腫瘤成分，具有高效無毒的特點(diǎn)，有開發(fā)的潛力[5-8]。本試驗(yàn)對海岸水虱體內(nèi)消化道微生物進(jìn)行富集、分離鑒定，旨在揭示其作為水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的潛在應(yīng)用。

本試驗(yàn)材料采自連云港高公島灘涂的海岸，從海岸水虱的消化道內(nèi)分離出1株產(chǎn)酶活性較高菌株，經(jīng)16S rRNA序列比對分子生物學(xué)鑒定，確定為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans），并對其產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶能力及影響因素進(jìn)行初期探索，旨在揭示其作為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的潛在應(yīng)用，可以為益生菌的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海岸水虱 海岸水虱采自連云港高公島潮間帶。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏1.5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉2.5 g，水500 mL，pH 7.2，121 ℃高壓滅菌20 min;牛奶平板：在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量為1.5%的脫脂奶粉。淀粉液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨2.5 g，氯化鈉2.5 g，可溶性淀粉1 g，500 mL無菌水，pH 7.5左右，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3 試劑 DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒、PCR擴(kuò)增及其他分子生物學(xué)試劑購自TAKARA公司;PCR引物合成由TAKARA公司完成;16S rRNA由上海派森諾公司完成測序;蛋白酶及淀粉酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將采集的海岸水虱先用70%乙醇沖洗軀體表面2次，再無菌水沖洗5～6次，最后1次的洗滌液作為對照接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌測試;無菌條件下，用無菌剪刀剪開海岸水虱軀體，切開消化道，取其內(nèi)容物接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，后對培養(yǎng)物進(jìn)行平板分離純化，挑取1株優(yōu)勢菌，命名HZL-3，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株鑒定 應(yīng)用DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒抽提HZL-3的基因組DNA，以其為模板，用27F和1492R引物對其16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性 95 ℃ 5 min;變性 94 ℃ 30 s;退火 51 ℃ 40 s;延伸 72 ℃ 90 s;終止延伸 72 ℃ 10 min;30個循環(huán)），結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海派森諾公司完成測序，測序結(jié)果提交到NCBI，進(jìn)行序列比對分析及同源性比較，用MEGA5.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

引物序列：27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT。

1.2.3 產(chǎn)酶特性研究 制備牛奶平板，將菌液稀釋，取10-4、10-5 2個稀釋度進(jìn)行平板涂布，培養(yǎng)24 h觀察，確定是否產(chǎn)蛋白酶。制備淀粉固體培養(yǎng)基，將菌液稀釋，取10-4、10-5 2個稀釋度進(jìn)行平板涂布，培養(yǎng)24 h后，盧戈氏碘液鑒定是否產(chǎn)生水解圈，確定淀粉酶的產(chǎn)生。

1.2.4 產(chǎn)酶影響因素研究

1）培養(yǎng)溫度對HZL-3菌株產(chǎn)酶的影響。試驗(yàn)分別設(shè)置25、28、32、36、40 ℃不同的培養(yǎng)溫度，其他條件固定為pH為7，轉(zhuǎn)速140 r/min，接種量4%，培養(yǎng)24 h通過酶聯(lián)免疫分析（雙抗體夾心法）測定酶濃度來研究培養(yǎng)溫度對HZL-3菌株產(chǎn)酶的影響。蛋白酶及淀粉酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用根據(jù)說明書。

2）培養(yǎng)基pH對HZL-3菌株產(chǎn)酶的影響。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。其他條件為溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速140 r/min，接種量 4%，培養(yǎng)24 h后測酶濃度，測定方法同上。

3）培養(yǎng)時間對HZL-3菌株產(chǎn)酶的影響。將HZL-3菌分別培養(yǎng)8、10、16、24、36 h后測其酶濃度，其他條件為溫度37 ℃，pH 7，轉(zhuǎn)速140 r/min，接種量4%。測定方法同上。

4）接種量對HZL-3菌株產(chǎn)酶的影響。分別設(shè)置接種量比例為2%、4%、6%、8%、10%。其他條件固定為溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速140 r/min，pH 7，培養(yǎng)24 h。測定方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

PCR產(chǎn)物送上海派森諾生物科技公司測序，得1 041 bp序列。將該序列于NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast序列比對并用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，初步確定HZL-3菌株為凝結(jié)芽孢桿菌（圖1）。HZL-3菌株菌落較大，邊緣光滑，呈乳白色，為革蘭陽性菌。顯微鏡下菌體呈桿狀，具芽孢。HZL-3 菌株在28～40 ℃生長較好，對溫度具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，適宜pH 7.5。吲哚反應(yīng)、接觸酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)均為陽性，VP試驗(yàn)為陰性。

2.2 HZL-3菌株產(chǎn)酶試驗(yàn)

用牛奶固體培養(yǎng)基和淀粉固體培養(yǎng)基經(jīng)24 h培養(yǎng)后可見牛奶平板上出現(xiàn)明顯的透明圈，淀粉平板盧戈氏碘液覆蓋處出現(xiàn)明顯的水解圈，說明該菌能夠分泌產(chǎn)生蛋白酶和淀粉酶，屬于胞外酶。牛奶平板和淀粉平板的透明圈直徑分別為（2.9±0.2） mm和（5.8±0.3） mm。

2.3 HZL-3菌株產(chǎn)酶影響因素研究

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)上述方法，分別制作蛋白酶與淀粉酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對HZL-3菌株產(chǎn)酶的影響 影響微生物產(chǎn)酶能力，溫度是關(guān)鍵因素，培養(yǎng)24 h后測其蛋白酶與淀粉酶含量，結(jié)果如圖3所示，蛋白酶與淀粉酶的含量均自25 ℃開始呈持續(xù)上升趨勢，直至36 ℃時達(dá)最高，36～40 ℃呈下降趨勢，40 ℃時，酶含量最低，淀粉酶和蛋白酶36 ℃最高值分別高于40 ℃時的43%、32%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，均呈極顯著差異（Plt;0.01），其他溫度條件差異不大。

2.3.3 培養(yǎng)基pH對HZL-3菌株產(chǎn)酶的影響 不同微生物的生長繁殖及代謝物積累對pH的要求不同，本試驗(yàn)24 h后測得酶濃度結(jié)果見圖4。由圖4可知，淀粉酶在pH 6.0時酶含量最高，偏酸性酶，后開始下降，pH 7.5時最低，只有最高值的28.7%，差異極顯著（Plt;0.01）;蛋白酶含量自pH 6.0時開始呈持續(xù)上升趨勢，pH 7.5時達(dá)最高值，后開始下降，偏弱堿性酶。在設(shè)計的pH范圍內(nèi)，pH 6.0時蛋白酶含量最低，只有最高值的48.7%，差異極顯著（Plt;0.01）。

2.3.4 培養(yǎng)時間對HZL-3菌株產(chǎn)酶的影響 如圖5所示，淀粉酶自8 h培養(yǎng)至10 h，酶含量大幅度升高，10 h達(dá)到最高值，后開始持續(xù)下降，且下降幅度較大，36 h最低，只有最高值的17.5%，差異極顯著（P lt;0.01）;而蛋白酶含量自8 h開始呈持續(xù)上升趨勢，上升幅度較淀粉酶小，至16 h達(dá)最高值，后開始下降，36 h最低，只有最高值的35.8%，二者相比差異顯著（P lt;0.05）。

2.3.5 接種量對HZL-3菌株產(chǎn)酶的影響 接種量是指移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量不同會影響微生物生長及代謝產(chǎn)物的積累，也可能對微生物產(chǎn)酶能力有所影響，如圖6所示，在接種量為4%時，淀粉酶含量最高，隨接種量逐步提高，產(chǎn)酶能力逐漸下降;而蛋白酶含量在6%時最高。后隨接種量逐步提高，產(chǎn)酶能力同樣逐漸下降。

3 討論

益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中能夠凈化水質(zhì)、預(yù)防疾病、促進(jìn)生長且安全、環(huán)保、無抗性，是抗生素的理想替代品，具有重要的研究價值和廣闊的應(yīng)用前景。目前研究者認(rèn)為芽孢桿菌是一種發(fā)展?jié)摿艽蟮膬?yōu)良益生菌之一[9]。芽孢桿菌具有許多優(yōu)點(diǎn)，具有芽孢，即它的休眠狀態(tài)，當(dāng)其環(huán)境條件滿足不了它的生長要求時，會形成芽孢以度過不良環(huán)境，環(huán)境適宜時又可萌發(fā)成新的菌體;另外，芽孢桿菌的產(chǎn)酶活性強(qiáng)，有利于作用物的消化代謝[9]。凝結(jié)芽孢桿菌為芽孢桿菌屬，是最具潛力的益生菌之一，能產(chǎn)生多種酶類，還具有抗菌抑菌活性，不僅可以用于醫(yī)學(xué)、生產(chǎn)等領(lǐng)域，而且已經(jīng)滲入到人類生活的各個方面。近年來越來越受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛的關(guān)注與研究[10-15]。以海洋生物酶為核心內(nèi)容的生物技術(shù)在支持社會進(jìn)步與經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的地位已被多個國家提到空前的戰(zhàn)略高度，成為開發(fā)新型酶的新源地[16]。海岸水虱生活環(huán)境及生活習(xí)性獨(dú)特，而關(guān)于海岸水虱消化道分離凝結(jié)芽孢桿菌的試驗(yàn)未見報道。

試驗(yàn)針對海岸水虱消化道微生物，采用傳統(tǒng)的微生物富集、分離純化方法，對海岸水虱消化道微生物進(jìn)行分離鑒定，得到1株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株，命名為HZL-3，利用分子生物學(xué)方法，初步確定為凝結(jié)芽孢桿菌，并研究該菌株產(chǎn)酶能力影響因素，采用ELISA法檢測HZL-3產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶含量，并研究溫度、pH、培養(yǎng)時間、接種量等因素對產(chǎn)酶量的影響。結(jié)果顯示，HZL-3能夠產(chǎn)生蛋白酶和淀粉酶;溫度36 ℃，pH為7.5，培養(yǎng)16 h，接種量為6%，蛋白酶活性最高;溫度36 ℃，pH為6.0，培養(yǎng)10 h，接種量為4%，淀粉酶活性最高。HZL-3菌株在40 ℃時產(chǎn)酶能力明顯下降，菌體生長活力及生長速率下降嚴(yán)重，與李楊霞等[17]報道的嗜熱凝結(jié)芽孢桿菌最適生長溫度有很大差別，筆者認(rèn)為存在種屬差異性。芽孢桿菌是益生菌的一種，與其他益生菌相比，芽孢桿菌具有其獨(dú)特的優(yōu)勢，形成的內(nèi)生孢子能耐受自然界及加工過程中的高溫、干燥和紫外線等不利因素，是益生菌菌種開發(fā)的重要來源。對于HZL-3菌株作為益生菌的耐酸、耐鹽及對飼料酶系的利用能力等特性有待進(jìn)一步研究。

海岸水虱屬于雜食性動物，主要喜食海藻，偶爾攝食一些動物殘肢，清除海岸帶大型藻類碎屑和動物殘體，是潮間帶重要的生態(tài)系成員之一，常作為海濱污染指示生物[18]，由于獨(dú)特的生活環(huán)境及生活習(xí)性，其消化道共生微生物必然有其特殊性，本試驗(yàn)結(jié)果旨在揭示海岸水虱消化道微生物一些特性，為開發(fā)其在水生動物健康養(yǎng)殖方面的潛在應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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