摘要：采用中藥指紋圖譜技術(shù)建立厚樸花藥材的高效液相色譜指紋圖譜，為其質(zhì)量控制提供新方法。以甲醇超聲提取30 min，制備供試品溶液;以甲醇和水（0.1%甲酸）為流動(dòng)相，梯度洗脫;分析時(shí)間為60 min;檢測波長為230 nm;柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min。對厚樸花樣品進(jìn)行測定，以和厚樸酚為參照物，確定了厚樸花指紋圖譜中的9個(gè)共有峰;通過方法學(xué)考察，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性試驗(yàn)RSD均小于3%;采用相似度作為指紋圖譜的評判參數(shù)，厚樸花各樣品的色譜與對照指紋圖譜之間相似度均大于0.9。

關(guān)鍵詞：厚樸花;HPLC;指紋圖譜;質(zhì)量控制

中圖分類號：R282 " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2022）03-0134-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2022.03.027 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on fingerprint of Magnoliae officinalis flos

YANG Hong-bing1，YANG Jia1，SHI Lei1，ZHAN Zhi-lai2

（1. School of Pharmacy， Hubei College of Traditional Chinese Medicine，Wuhan "430065，China;

2. State Key Laboratory of Dao-di Herbs/National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，

Beijing "100700，China）

Abstract： The HPLC fingerprint of Magnolia officinalis flos was used to provide a new method for its quality control. Ultrasonic extraction with methanol for 30 min to prepare the test solution; Gradient elution was performed with methanol and water （0.1% formic acid） as mobile phases. The analysis time was 60 min. The detection wavelength was 230 nm. Column temperature was 30 ℃. The flow rate was 1.0 mL/min. Dozens batches of magnoliae officinalis flos were determined， and nine common peaks in the fingerprint of Magnoliae officinalis flos were determined with honokiol as the reference. The RSD of precision， stability and reproducibility tests were allless than 3% through methodological investigation. Using similarity as the evaluation parameter of fingerprint， the similarity between the chromatogram of Magnoliae officinalis flos samples and the control fingerprint was more than 0.9.

Key words： Magnoliae officinalis flos; HPLC; fingerprint; quality control

厚樸花藥材為木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）或凹葉厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils. var. biloba Rehd. et Wils.）的干燥花蕾[1]，主要產(chǎn)于湖南、湖北、四川、浙江、福建等省。厚樸花藥材有2種植物來源，產(chǎn)地也各有不同，其品質(zhì)理應(yīng)有所區(qū)別。但《中國藥典》2020年版一部[1]厚樸花項(xiàng)下沒有顯示2種來源的差異和特征圖譜，也鮮見國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)厚樸花的指紋圖譜。本研究采用中藥指紋圖譜技術(shù)建立厚樸花藥材的HPLC指紋圖譜，為厚樸花質(zhì)量控制提供新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

島津LC20A高效液相色譜儀，軟件工作站LabSolutions，檢測器型號SPD-20A。HX-30超聲波清洗機(jī)（武漢恒信世紀(jì)科技有限公司）。甲醇為色譜純（TEDIA，美國天地有限公司），甲酸為分析純（廣州化學(xué)試劑廠），水為重蒸餾水。厚樸酚、和厚樸酚對照品（純度均>98.5%）購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110729-201513和110730-201313。

1.2 藥材樣品

10批采自湖南道縣洪塘營瑤族鄉(xiāng)、原植物為凹葉厚樸的厚樸花藥材樣品（簡稱道縣產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花），10批采自湖北省恩施市新塘鄉(xiāng)、原植物為厚樸的厚樸花藥材樣品（簡稱恩施產(chǎn)厚樸源厚樸花），另外有10批來源于新塘鄉(xiāng)種植的凹葉厚樸的厚樸花藥材樣品（簡稱恩施產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花）。

1.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相高效液相色譜柱。流動(dòng)相為甲醇-水（0.1%甲酸）溶液。梯度洗脫，洗脫條件見表1，分析時(shí)間60 min。檢測波長為230 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

1.4 對照品溶液的制備

同藥典[1]方法。取厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含厚樸酚60 μg、和厚樸酚40 μg的溶液，即得。

1.5 供試品溶液的制備

同藥典[1]方法。取本品粗粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，放置30 min，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液作供試品。

1.6 參照峰的選擇

通過比較對照品的保留時(shí)間和光譜圖，對供試品色譜峰的歸屬進(jìn)行分析，其中和厚樸酚為厚樸花的主要有效成分之一，出峰時(shí)間適中，與相鄰峰分離較好，且峰面積較大，故定為參照峰，以計(jì)算其他共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。

1.7 相似度計(jì)算方法

采用國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版”計(jì)算相似度，并生成厚樸花的對照用指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度

取同一供試品溶液（S1），按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算色譜圖中各共有峰相對保留時(shí)間（RRT）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和相對峰面積（RA）的RSD。凹葉厚樸源厚樸花樣品的RSD分別為0.061%～0.285%和0.137%～2.703%，厚樸源厚樸花樣品的RSD分別0.038%～0.376%和0.261%～2.404%，表明儀器精密度良好。RSD均小于3%，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.2 穩(wěn)定性

取同一供試品溶液（S1），按色譜條件分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)行測定，計(jì)算各共有峰RRT的RSD和RA的RSD。凹葉厚樸源厚樸花樣品的RSD分別為0.072%～0.304%和0.139%～2.861%，厚樸源厚樸花樣品的RSD分別0.061%～0.445%和0.241%～2.656%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 重復(fù)性

取同一批藥材樣品（S1）5 份分別制備供試品溶液進(jìn)行檢測，計(jì)算色譜圖中各共有峰RRT的RSD和RA的RSD。凹葉厚樸源厚樸花樣品的RSD分別為0.077%～0.345%和0.317%～2.865%，厚樸源厚樸花樣品的RSD分別0.072%～0.446%和0.430%～2.894%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜相似度

和厚樸酚、厚樸酚對照品色譜見圖1。10批道縣產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花樣品HPLC色譜見圖2，對照用指紋圖譜見圖3，其色譜圖相似度計(jì)算結(jié)果見表2。

由圖2可見，道縣產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花各樣品間HPLC色譜圖中峰數(shù)、峰形、峰位（保留時(shí)間）等基本一致，峰高、峰面積或相對峰面積有所差異。由表2可知，樣品間色譜圖相似度以及與對照用指紋圖譜的相似度均大于0.9，說明共有峰的保留時(shí)間或相對保留時(shí)間較為一致。

10批恩施產(chǎn)厚樸源厚樸花樣品HPLC色譜見圖4，對照用指紋圖譜見圖5，其色譜圖相似度計(jì)算結(jié)果見表3。

由圖4可見，恩施產(chǎn)厚樸源厚樸花各樣品間HPLC色譜圖中峰數(shù)、峰形、峰位（保留時(shí)間）等基本一致，峰高、峰面積或相對峰面積有所差異。由表3可知，樣品間色譜圖相似度大于0.7，批次間的差異較道縣樣品明顯;各樣品色譜圖與對照用指紋圖譜的相似度均大于0.9，說明共有峰的保留時(shí)間或相對保留時(shí)間較為一致。

另外，10批恩施產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花樣品的色譜圖相似度計(jì)算結(jié)果見表4。同時(shí)，對恩施產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花（簡稱恩凹）與恩施產(chǎn)厚樸源厚樸花（簡稱恩尖）以及道縣產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花（簡稱道凹）三者之間色譜圖的相似度進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表5。

由表4可知，10批恩施產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花樣品之間色譜圖的相似度以及各樣品色譜圖與對照指紋圖譜的相似度，均只有部分在0.9以上，說明共有峰的保留時(shí)間或相對保留時(shí)間較不一致，無法建立有效的具有恩施產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花特征的HPLC指紋圖譜。由表5可知，恩凹與恩尖、道凹三者之間色譜圖的相似度均較低，其中恩凹與恩尖的相似度相對較高，與道凹較低，恩尖與道凹的相似度最低。

2.5 指紋圖譜的建立

厚樸花提取物的所有色譜峰在60 min內(nèi)全部出現(xiàn)，記錄60 min色譜圖即得。

比較10批道縣產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花供試品溶液的色譜圖，確定9個(gè)共有峰（特征峰），其中強(qiáng)峰3個(gè)：峰7（和厚樸酚）、峰8（未知成分）、峰9（厚樸酚）。以7號峰作為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間（RRT）和相對峰面積（RA），分別見表6、表7，結(jié)果符合指紋圖譜要求。

由表6、表7可知，道縣產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花9個(gè)共有峰（特征峰）相對保留時(shí)間較為一致，RSD為0.054%～0.184%;而相對峰面積有所差異，與圖2、表2結(jié)果一致。

比較10批恩施產(chǎn)厚樸源厚樸花供試品溶液的色譜圖，確定9個(gè)共有峰（特征峰），其中強(qiáng)峰3個(gè)：峰7（和厚樸酚）、峰8（未知成分）、峰9（厚樸酚）。以7號峰作為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間（RRT）和相對峰面積（RA），分別見表8、表9，結(jié)果符合指紋圖譜要求。

由表8、表9可知，恩施產(chǎn)厚樸源厚樸花9個(gè)共有峰（特征峰）相對保留時(shí)間較為一致，RSD為0.037%～1.395%，而相對峰面積有所差異，與圖4、表3結(jié)果一致。

另外，道凹（道縣產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花，同前）與恩尖以及恩凹三者間厚樸酚與和厚樸酚峰面積之比（特征Ⅰ）、8號峰峰面積與和厚樸酚面積的比例（特征Ⅱ）見表10。

由表10可知，不同產(chǎn)地、品種厚樸花間厚樸酚與和厚樸酚峰面積之比、8號峰峰面積與和厚樸酚峰面積之比，均存在明顯差異，這兩個(gè)指標(biāo)可作為道縣產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花、恩施產(chǎn)厚樸源厚樸花的HPLC圖譜特征（特征Ⅰ、Ⅱ）。整體看恩施產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花與恩施產(chǎn)厚樸源厚樸花相近似。

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，藥典方法操作簡便快捷，出峰適中且分離好，故采取藥典方法制備供試品溶液[2-6]。考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-甲酸、乙腈-水-甲酸等多種流動(dòng)相及其配比，比較了等度與梯度洗脫。結(jié)果表明，以甲醇-水（0.1%甲酸）為流動(dòng)相，梯度洗脫時(shí)，基線較平穩(wěn)，色譜峰得到較好分離。

分別比較了230、254、260、290 nm波長下的色譜圖，結(jié)果表明230 nm波長下指紋圖譜中各色譜峰分離良好，峰數(shù)較多，和厚樸酚、厚樸酚的吸收較大，故選擇該波長作為檢測波長。同時(shí)在相同條件下，分別比較了Acclaim C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Welchrom C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的色譜圖，均有較好的出峰效果，均可以使用。

3.2 討論

和厚樸酚與厚樸酚是中藥厚樸花的主要有效成分[7，8]，含量較高，是評價(jià)厚樸花藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。同時(shí)以和厚樸酚與厚樸酚為主，綜合多種成分及相互之間的數(shù)量、比例的HPLC色譜指紋圖譜，能夠有效地表征厚樸花內(nèi)在品質(zhì)，為厚樸花藥材的質(zhì)量控制與品種鑒別提供新的方法。本研究表明，10批道縣產(chǎn)厚樸花各樣品間HPLC色譜圖相似度以及與對照用指紋圖譜的相似度均較高（>0.9）。根據(jù)國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版”生成的對照用指紋圖譜可作為道縣產(chǎn)厚樸花的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，共有峰（特征峰）9個(gè)。10批恩施產(chǎn)厚樸花各樣品HPLC色譜圖與對照用指紋圖譜的相似度較高（>0.9）。根據(jù)國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版”生成的對照用指紋圖譜可作為恩施產(chǎn)厚樸花的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，共有峰（特征峰）9個(gè)。其中厚樸酚（9號峰）與和厚樸酚（7號峰）峰面積之比、8號峰峰面積與和厚樸酚（7號峰）峰面積之比，可分別作為道縣產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花、恩施產(chǎn)厚樸源厚樸花的HPLC圖譜特征（特征Ⅰ、Ⅱ）。另外，恩施產(chǎn)凹葉厚樸源厚樸花的情況值得關(guān)注和進(jìn)一步研究探討。研究表明，恩施引種凹葉厚樸，由于地理及生態(tài)環(huán)境的影響，有效成分積累的規(guī)律發(fā)生了某些變化，與本地傳統(tǒng)種植品種厚樸產(chǎn)生了趨同現(xiàn)象。

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