張競(jìng)男， 苑 紅， 馬春麗， 李 麗， 徐宋瑤，張俊鋒， 霍 達(dá)， 任貴強(qiáng)， 扈瑞平*

（1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

進(jìn)入互聯(lián)網(wǎng)時(shí)代，伴隨人們生活方式的改變和不良飲食習(xí)慣的影響，肥胖、糖尿病、脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化等代謝性疾病的發(fā)病率逐漸上升，已經(jīng)成為威脅大眾健康的普遍公共衛(wèi)生問題。 代謝性疾病的主要發(fā)病原因是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝過剩誘發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)[1]。 近年來許多研究證實(shí)腸道菌群與代謝、炎癥反應(yīng)、免疫功能等密切相關(guān)，并參與脂代謝等生理過程[2-4]。

植物多糖的膳食干預(yù)可通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)或多樣性，發(fā)揮減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血脂代謝等作用[5]。 黃芪多糖（APS）是黃芪主要活性成分之一，作為免疫增強(qiáng)劑在抗腫瘤、抗病毒等方面具有免疫調(diào)節(jié)作用[6-7]；能夠有效調(diào)節(jié)血脂水平并改善胰島素抵抗，發(fā)揮控制血糖、改善心血管功能的作用[8-9]。 作者給高脂飲食小鼠自由飲用黃芪多糖溶液，通過考察小鼠血清炎癥因子和腸道菌群的變化，探究黃芪多糖是否可通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善其腸道炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

黃芪多糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%）：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品；30 只C57BL/6J 雄性小鼠：北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供；總膽固醇（TC）含量測(cè)定試劑盒、甘油三酯（TG）含量檢測(cè)試劑盒、小鼠脂多糖 （LPS）ELISA 試劑盒、 小鼠免疫球蛋白A（IgA）ELISA 試劑盒、小鼠免疫球蛋白M（IgM）ELISA 試劑盒、小鼠免疫球蛋白G（IgG）ELISA 試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒：江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；正庚烷、異丙醇（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Forma 900 series 超低溫冰箱、Multiskan FC 酶標(biāo)儀： 賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；DNP 型恒溫培養(yǎng)箱：精宏科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備及分組 將C57BL/6J 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為對(duì)照組（C） 、模型組（M）、黃芪多糖處理組（D），每組10 只。 對(duì)照組喂標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，模型組喂高脂飼料和飲用水，黃芪多糖處理組喂高脂飼料和2 g/dL 黃芪多糖溶液。 連續(xù)喂養(yǎng)11 周后采樣。

1.3.2 樣本采集和處理 取樣前12 h 禁食，收集小鼠糞便于離心管中用于高通量測(cè)序，記錄小鼠體質(zhì)量。 采用斷頭法取血于離心管中，靜置30 min，于4℃、3000 r/min 離心15 min，分離血清。 迅速剝離脾臟、腎臟周圍脂肪組織，并稱質(zhì)量。

1.3.3 血脂、LPS、炎癥因子、免疫球蛋白指標(biāo)的測(cè)定根據(jù)試劑盒說明測(cè)定血清樣本中的TC 濃度、TG 質(zhì)量濃度， 根據(jù)ELISA 試劑盒說明測(cè)定血清樣本中LPS 水平，根據(jù)ELISA 試劑盒說明測(cè)定血清樣本中IL-1β、IL-6、TNF-α 質(zhì)量濃度， 根據(jù)ELISA 試劑盒說明測(cè)定血清樣本中IgA、 IgG、IgM 質(zhì)量濃度。

1.3.4 腸道菌群分析 采用CTAB/SDS 方法提取總細(xì)菌基因組DNA。 選用上游引物515F（5′-GTGCC AGCMGCCGCGGTAA-3′）和下游引物806R（5′-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3～V4 區(qū)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示， 數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 進(jìn)行處理， 用Bonferroni 法進(jìn)行方差分析，分析組間差異，認(rèn)為P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 高通量測(cè)序結(jié)果采用OTUs 聚類分析法，進(jìn)行物種注釋及豐度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 APS 對(duì)體質(zhì)量、脂肪質(zhì)量、脾臟指數(shù)的影響

表1 為飼喂APS 后小鼠體質(zhì)量、 脂肪質(zhì)量、脾臟指數(shù)的變化。 與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量增加9.69%，脂肪質(zhì)量增加（P＜0.01），脾臟指數(shù)降低（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪多糖干預(yù)后小鼠體質(zhì)量增加，脂肪質(zhì)量減少，脾臟指數(shù)升高接近對(duì)照組小鼠，但均無明顯差異。

表1 各組小鼠的體質(zhì)量、脂肪質(zhì)量、脾臟指數(shù)比較Table 1 Comparison of the weight，the weight of fat and spleen index among the three groups

2.2 APS 對(duì)血脂水平的影響

APS 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血脂水平的影響如圖1 所示。由圖可知，與對(duì)照組相比，模型組總膽固醇、甘油三酯水平明顯升高（P＜0.01），說明高脂飲食喂養(yǎng)后小鼠脂質(zhì)代謝發(fā)生異常；與模型組相比，黃芪多糖處理組血清總膽固醇濃度明顯降低（P＜0.01）。 這說明APS 顯著改善了高脂飲食小鼠的總膽固醇異常狀態(tài)。

圖1 APS 對(duì)血脂水平的影響Fig. 1 Effect of APS on plasma indexes

2.3 APS 對(duì)血清中LPS 水平的影響

APS 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清LPS 水平的影響如圖2所示。與對(duì)照組相比，模型組LPS 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，黃芪多糖處理組LPS 水平顯著降低（P＜0.01）。 說明APS 能夠降低因高脂飲食引起的LPS 水平升高。

圖2 APS 對(duì)內(nèi)毒素LPS 水平的影響Fig. 2 Effect of APS on LPS

2.4 APS 對(duì)血清免疫球蛋白質(zhì)量濃度的影響

APS 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清免疫球蛋白質(zhì)量濃度的影響如圖3 所示。 與對(duì)照組相比，模型組IgA、IgG、IgM 質(zhì)量濃度降低，其中IgA、IgG 有顯著性差異（P＜0.05）。 與模型組相比， 黃芪多糖處理組小鼠血清IgA、IgG、IgM 質(zhì)量濃度升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高脂飲食影響血清中免疫球蛋白的質(zhì)量濃度，攝入APS能夠增加血清中免疫球蛋白質(zhì)量濃度。

圖3 APS 對(duì)血清免疫球蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig. 3 Effect of APS on serum immunoglobulin level

2.5 APS 對(duì)炎癥因子質(zhì)量濃度的影響

APS 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清炎癥因子質(zhì)量濃度的影響如圖4 所示。 與對(duì)照組相比，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α 質(zhì)量濃度均升高， 其中IL-1β、IL-6 差異明顯（P＜0.01）；與模型組相比，黃芪多糖處理組的IL-1β、IL-6、TNF-α 質(zhì)量濃度均降低，其中IL-1β 質(zhì)量濃度有顯著性差異（P＜0.01）。 高脂飲食導(dǎo)致血清炎癥因子增多，而APS 可以降低血清中炎癥因子質(zhì)量濃度，尤其是IL-1β 的質(zhì)量濃度。

圖4 APS 對(duì)炎癥因子質(zhì)量濃度的影響Fig. 4 Effect of APS on the level of inflammatory factors

2.6 APS 對(duì)腸道菌群的影響

如圖5 和表2 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠腸道內(nèi)的有益菌擬桿菌門（Bacteroidota）相對(duì)豐度下降（P＜0.05），有害菌厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度增加，且擬桿菌門與厚壁菌門比值減小，但差異不明顯。 與模型組小鼠相比，黃芪多糖干預(yù)后，擬桿菌門相對(duì)豐度有所增加，厚壁菌門相對(duì)豐度有下降趨勢(shì)，擬桿菌門與厚壁菌門比值升高，但差異不顯著。 說明長(zhǎng)期高脂膳食會(huì)破壞小鼠腸道門水平上的菌群比例， 引起小鼠腸道菌群紊亂，APS 可調(diào)節(jié)高脂膳食導(dǎo)致的菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)。

圖5 門水平上各組小鼠含量前10 的菌群物種相對(duì)豐度Fig. 5 Relative abundance of top 10 bacterial species of mice in each group at phylum level

表2 黃芪多糖對(duì)肥胖小鼠腸道擬桿菌門、 厚壁菌門相對(duì)豐度的影響Table 2 Effect of APS on relative abundance of Bacteroidota and Firmicutes in the obese mice

如圖6所示，在屬水平，對(duì)照組以Jeotgalicoccus、Desulfovibrio、Dubosiella 為主， 其中Jeotgalicoccus、Dubosiella 屬于厚壁菌門，Desulfovibrio屬于Desulfobacterota； 模型組以Lachnospiraceae_NK4A136_group、 Lactobacillus 、 Colidextribacter 、Intestinimonas 為主，均屬于厚壁菌門；黃芪多糖處理 組 以Ileibacterium、Bifidobacterium、Psychrobacter為主、其中Ileibacterium 屬于厚壁菌門，Bifidobacterium屬于放線菌門（Actinobacteriota），Psychrobacter 屬于變形菌門（Proteobacteria）。 與對(duì)照組相比，模型組小鼠以厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，說明高脂飲食改變腸道菌群結(jié)構(gòu)；黃芪多糖干預(yù)后，可改善因高脂飲食導(dǎo)致的菌群失調(diào)， 而且增加有益菌雙歧桿菌（Bifidobacterium）相對(duì)豐度。

圖6 屬水平上各組小鼠腸道菌群比例的三元圖Fig. 6 Ternary plot of the proportion of intestinal flora in each group at genus level

2.7 討論

研究表明，長(zhǎng)期高脂飲食可以持續(xù)改變腸道微生態(tài)[10]，腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡，引起致病菌數(shù)量增加，增加內(nèi)毒素產(chǎn)生， 影響腸上皮細(xì)胞的基因表達(dá)，使腸黏膜通透性增加[11-12]，內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)，激活TLRs（Toll 樣受體）家族中TLR4，觸發(fā)炎癥信號(hào)通路[13]。 除此之外，脂肪組織中的NLRs（NOD 樣受體）信號(hào)通路通常處于激活狀態(tài)[14]，其中NLRP3 以炎性小體的形式，促進(jìn)內(nèi)源性和外源性危險(xiǎn)信號(hào)轉(zhuǎn)化為IL-1。 大量研究提示巨噬細(xì)胞是脂肪組織中最主要的炎癥細(xì)胞[15]，脂代謝異常時(shí)巨噬細(xì)胞向M1 型巨噬細(xì)胞極化[16]，分泌IL-6、TNF-α 等炎癥因子，誘發(fā)持續(xù)的慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂[17-18]。 本實(shí)驗(yàn)中黃芪多糖能夠在門水平上增加擬桿菌門相對(duì)豐度，降低厚壁菌門相對(duì)豐度，升高擬桿菌門與厚壁菌門比值。 增加的擬桿菌門可以將植物中的糖類物質(zhì)分解為益生元，減輕炎癥[19]；擬桿菌門與厚壁菌門比值的上升直接影響腸道菌群對(duì)膳食纖維的代謝，使短鏈脂肪酸（Short chain fatty acid，SCFAs）濃度升高，SCFAs 可以誘導(dǎo)腸道中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞產(chǎn)生和分化，從而促進(jìn)抑炎因子IL-10 的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[20-21]。 在屬水平上有益菌雙歧桿菌屬增多，能夠改善小鼠內(nèi)毒素血癥[22]，并對(duì)腸黏膜屏障具有保護(hù)作用[23]，降低LPS 負(fù)荷，降低LPS 增多觸發(fā)的炎癥信號(hào)通路，減少血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度。 表明黃芪多糖可以調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌生長(zhǎng)，對(duì)腸道慢性炎癥起到抑制作用。

小鼠由于長(zhǎng)期高脂飲食，造成能量過剩，這部分能量轉(zhuǎn)化為脂肪儲(chǔ)存在體內(nèi)[24]。 當(dāng)血漿中膽固醇濃度增高時(shí)， 細(xì)胞膜膽固醇合成受抑制， 從而使B淋巴細(xì)胞增殖和對(duì)抗原信息的識(shí)別功能受到限制，進(jìn)而導(dǎo)致免疫球蛋白分泌減少[25]。 黃芪多糖作為中藥黃芪的活性成分，既可以在免疫低下時(shí)提高機(jī)體免疫力，又可以在炎癥持續(xù)時(shí)，降低炎性水平[26]。 本研究中黃芪多糖可通過提高免疫器官脾臟指數(shù)，促進(jìn)免疫球蛋白分泌，增強(qiáng)小鼠免疫功能，降低炎癥因子水平。 已有文獻(xiàn)報(bào)道，臨床常用藥物二甲雙胍可以降低血清炎癥因子IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平[27]，抑制炎癥發(fā)展[28-30]。

3 結(jié)語

黃芪多糖能夠調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)小鼠免疫功能，抑制LPS 引起的腸道炎癥，改善脂代謝異常。 黃芪多糖與二甲雙胍在抑制腸道炎癥方面具有相似功效，為將其開發(fā)作為預(yù)防或治療代謝性疾病的保健品或藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。