邢曉旭，馮學(xué)慧

（1.太原動物園，太原 030009；2.大同市動物疫病預(yù)防控制中心，山西 大同 037000）

隨著社會文明的進步，動物福利不斷受到人們關(guān)注，尤其是一些伴侶動物，它們的老年生活質(zhì)量也越來越受人們重視。跟人類一樣，骨質(zhì)疏松等骨科疾病也困擾著它們。近年來的研究發(fā)現(xiàn)西藥在治療骨科疾病方面存在不良作用大、遠期療效不肯定、價格昂貴等缺點，因此中藥的應(yīng)用進入到了人們的視野。

根據(jù)中醫(yī)“腎主骨生髓”的理論，臨床上多采用復(fù)方或是單味補腎中藥治療骨質(zhì)疏松等骨科疾病，效果良好但機理尚不清楚[1]。

中藥杜仲為杜仲科植物杜仲的樹皮[2]，能夠補肝腎強筋骨，甘微辛，溫，入肝腎經(jīng)。本研究旨在通過探討常用補腎中藥杜仲水提液對大鼠成骨細胞BMP2基因表達的影響，來揭示杜仲在防治骨質(zhì)疏松癥等骨科疾病方面的機理，為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 試驗動物

出生24 h 內(nèi)的SD 大鼠乳鼠，是由購自凱學(xué)生物科技公司的SD大鼠自行繁殖獲得。

1.2 試驗藥物

中藥杜仲是植物杜仲的樹皮，購于同仁堂藥店。

1.3 試驗試劑

DMEM 完全培養(yǎng)基、膠原酶，Gibco 公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒，TransGen Biotech公司產(chǎn)品；PCR引物、BMP2引物，生工生物工程（上海）有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR 儀，Applied Biosystems公司生產(chǎn)。

2 方 法

2.1 大鼠成骨細胞的培養(yǎng)

取出生24 h 內(nèi)的大鼠10 只，用醫(yī)用乙醇浸泡消毒后，在無菌超凈臺內(nèi)用高壓滅菌的外科手術(shù)器分離出顱骨，經(jīng)2次酶消化后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，離心后用完全培養(yǎng)基制成細胞混懸液鋪于細胞板內(nèi)。放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

2.2 大鼠成骨細胞的鑒定

培養(yǎng)的細胞采用瑞氏染色、茜素紅鈣化染色進行鑒定[3]。

2.3 杜仲皮水提液的制備

將中藥杜仲100 g與純化水按1∶10混合后浸泡1 h。煮沸后文火煎30 min，過濾藥液。重復(fù)煎煮1次，將2次過濾藥液合并，離心后取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成濃度為1 g·mL-1的溶液。調(diào)pH值至7.2～7.4，然后用0.22 μm的微孔濾膜過濾，用DMEM維持培養(yǎng)液（含4%標準胎牛血清）稀釋配制成含藥量分別為3×10-1mg·mL-1、3×10-2mg·mL-1、3×10-3mg·mL-1、3×10-4mg·mL-1和3×10-5mg·mL-1作為試驗組，以不加藥的DMEM維持培養(yǎng)液作為對照組。

2.4 總RNA的提取及cDNA的合成

取第2代成骨細胞，分別加入含不同濃度藥液的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后收集細胞。

用Trizol法提取成骨細胞的總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄。BMP2和β-actin 的基因序列參考相關(guān)報道[4]。見表1。

表1 成骨細胞BMP2和β-actin引物序列

2.5 制備熒光PCR標準曲線及目的基因檢測

將目的基因純化回收后與克隆載體連接。將經(jīng)過鑒定的陽性菌測序后分別提取出β-actin和BMP2的質(zhì)粒。將標準質(zhì)粒按倍數(shù)稀釋后制備標準曲線。最終將各個濃度的cDNA進行實時熒光PCR基因檢測，通過標準曲線算出相對拷貝數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 大鼠成骨細胞的鑒定

培養(yǎng)細胞經(jīng)瑞氏染色后可見呈典型成骨細胞形態(tài)。經(jīng)茜素紅染色后有明顯礦化結(jié)節(jié)，符合成骨細胞特點。可確定培養(yǎng)的細胞是大鼠成骨細胞（見圖1）。

3.2 目的基因的鑒定

重組質(zhì)粒測序后，通過對陽性菌液的測序，得到BMP2 和β-actin 擴增產(chǎn)物的核苷酸序列，在GenBank 上進行BLAST-N 分析，發(fā)現(xiàn)β-actin 與已知大鼠的mRNA 序列的部分核苷酸同源性為100%；BMP2與已知大鼠的mRNA序列的部分核苷酸同源性為99%（見圖2 和圖3）。證明所制備的質(zhì)粒含有目的基因，序列可靠，純度良好。

3.3 杜仲皮水提液對大鼠BMP2表達的影響

不同濃度杜仲皮水提液對大鼠成骨細胞BMP2基因表達的影響見圖4。由圖4 可知，大鼠成骨細胞BMP2 基因表達量與杜仲皮水提液的濃度成正比，而與作用的時間成反比。其中3×10-1mg·mL-1組的BMP2的表達量與對照組相比有極顯著差異，3×10-2mg·mL-1組在作用24 h 時與對照組相比差異極顯著。相同濃度藥物作用時，作用24 h時的BMP2的基因表達量增多，尤其是3×10-1mg·mL-1、3×10-2mg·mL-1作用48 h和72 h后與24 h相比有顯著差異。

圖4 不同濃度杜仲皮水提液在不同時間對BMP2/β-actin值的影響

4 討 論

機體內(nèi)骨組織在不停地進行舊骨的吸收和新骨的形成[5]。在這個過程中成骨細胞扮演了重要的角色，在骨形成的過程中分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)經(jīng)過礦化后形成新骨[6]。BMP2 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的一員[7]，能夠誘導(dǎo)骨組織形成骨組織局部生長因子，是骨修復(fù)中最重要的誘導(dǎo)因子[8]。有研究表明局部注射補充BMP2可在短期內(nèi)預(yù)防骨折，BMP2基因的表達與老年性骨質(zhì)疏松有密切的關(guān)系[9-10]。

β-actin 作為內(nèi)參是管家基因的一種，它在不同的組織細胞中表達量基本一致。因此最終結(jié)果采用BMP2 與β-actin 的比值來表示，即采用的是BMP2基因表達的相對濃度來進行相互比較，可以減少試驗過程中的誤差，增加試驗的準確率。

本試驗采用實時熒光定量PCR 法，通過檢測不同濃度杜仲皮水提液對大鼠成骨細胞BMP2 基因與β-actin 比值的影響，來研究其對大鼠成骨細胞BMP2 基因表達的影響。從試驗結(jié)果可以看出，與對照組相比，較高濃度（3×10-1mg·mL-1）的杜仲皮水提液能顯著地提高大鼠BMP2基因的表達，尤其作用24 h，對BMP2基因的表達具有很強的促進作用。

5 結(jié) 論

研究表明杜仲皮水提液能夠在基因水平促進大鼠成骨細胞BMP2 基因的表達，在較高濃度（3×10-1mg·mL-1）、作用24 h時促進作用更加明顯。