梁青松，賈軍，胡欣，羅暉△

（南充市中心醫(yī)院 1.胸心外科；2.呼吸內(nèi)科；3.腫瘤科，南充 637000）

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，其死亡率位于惡性腫瘤首位。肺腺癌是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的一種常見類型，由于細胞增殖、遷移較快，侵襲性強，導(dǎo)致患者5年生存率較低，研究其發(fā)生和發(fā)展的分子機制，探尋靶向分子藥物具有重要意義[1- 2]。微小RNA-138-5p（miR-138-5p）在胃癌[3]、前列腺癌[4]、肝癌[5]等腫瘤中低表達，參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、血管生成等。研究顯示，miR-138-5p在NSCLC中表達下調(diào)，與腫瘤TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有關(guān)[6]；miR-138-5p可靶向下調(diào)程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）激活免疫系統(tǒng)抑制NSCLC腫瘤生長[7]。PD-L1為PD-1配體，具有負(fù)性調(diào)控免疫反應(yīng)的作用，在腫瘤中高表達，與腫瘤免疫逃逸有關(guān)[8]。miR-138-5p是否通過靶向調(diào)控PD-L1影響肺腺癌細胞的增殖、遷移和EMT，目前尚不清楚。本研究旨在探索miR-138-5p對肺腺癌細胞（H1299）增殖、遷移及EMT的影響，并進一步闡明其作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑與儀器 人支氣管上皮細胞（BEAS-2B）、人肺腺癌細胞（H1299、HCC827、A549、H1975）購于中國科學(xué)院細胞庫；DMEM培養(yǎng)基（12800017）、胎牛血清（10099141）購自美國Gibco公司；miR-138-5p過表達質(zhì)粒（miR-138-5p mimics）及陰性對照（miR-NC）、PD-L1過表達質(zhì)粒（PDL1）及空載質(zhì)粒（pcDNA）、抑制PD-L1表達（si-PD-L1）及陰性對照（si-NC）質(zhì)粒及miR-138-5p、U6引物購自上海生工生物工程股份有限公司；RNA提取試劑（10296010）、Lipofectamine 2000（11668-019）購自Invitrogen公司；RIPA細胞裂解液（P0013B）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（RG005）、CCK-8試劑盒（C0037）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人PDL1（ab243877）、PCNA（ab92552）、MMP-9（ab228402）、E-cadherin（ab40772）、N-cadherin（ab76011）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718）抗體購自Abcam公司。MK3型全自動酶標(biāo)儀、ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國Thermofisher公司；CKX31型倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；K8500凝膠成像系統(tǒng)購自南京世研儀器。

1.2標(biāo)本來源 選擇2019年3月至2021年5月在本院手術(shù)治療的肺腺癌患者42例，其中男29例，女13例，年齡35～78歲，平均（54.50±9.70）歲，手術(shù)過程中取肺腺癌組織與癌旁組織，置于-80℃冰箱中保存，患者術(shù)前未曾接受放、化療。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情并同意。

1.3細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 培養(yǎng)BEAS-2B、H1299、HCC827、A549、H1975細胞。將H1299細胞接種于6孔板中（2×105個細胞/孔），待細胞生長融合至70%～80%時，使用Lipofectamine 2000進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，將H1299細胞分為Control組、miR-NC組、miR-138-5p mimics組、si-NC組、si-PD-L1組、miR-138-5p mimics+pcDNA組和miR-138-5p mimics+PD-L1組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗。

1.4雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?根據(jù)生物信息學(xué)軟件（genecards）在線預(yù)測顯示，miR-138-5p與PDL1 3’UTR有結(jié)合區(qū)域，分別構(gòu)建野生型PD-L1-WT或突變型PD-L1-MUT質(zhì)粒，將對數(shù)生長期的H1299細胞接種于24孔板中培養(yǎng)24 h后，取上述質(zhì)粒分別與miR-138-5p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染H1299細胞48 h，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定相對熒光素酶活性。

1.5實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-138-5p水平 采用RT-qPCR法檢測肺腺癌組織、癌旁組織及肺腺癌細胞、支氣管上皮細胞中miR-138-5p相對表達量。miR-138-5p上游引物（5’-3’）：GCGAGCTGGTGTTGTGAATC，下游引物（5’-3’）：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT；U6上游引物（5’-3’）：CTCGGCTTCGGCAGCACA，下游引物（5’-3’）：AACGCTTCACGAATTTGCGT。miR-138-5p擴增條件：95℃，5 min孵育；94℃，15 s變性，60℃，30 s退火，70℃，45 s延伸，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算miR-138-5p相對表達量。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖 轉(zhuǎn)染后的生長良好的H1299細胞以每孔1×105個細胞接種至96孔板中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24 h、48 h、72 h時間點，每孔加入10μL的CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h后，全自動酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度（OD450 nm）值。

1.7劃痕實驗檢測細胞遷移 取轉(zhuǎn)染48 h的H1299細胞，以每孔1×104個細胞接種至6孔板中，待細胞完全貼壁后，使用200μL移液器槍頭在每孔垂直劃線，PBS洗去漂浮細胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察，并計算劃痕愈合率，劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.8免疫印跡法（western blotting）檢測細胞中PDL1、PCNA、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染后的H1299細胞，加入200μL RIPA細胞裂解液制備細胞裂解物，離心取上清液，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加PDL1（1∶1 000）、PCNA（1∶1 500）、MMP-9（1∶2 000）、E-cadherin（1∶1 500）、N-cadherin（1∶1 000）一抗和βactin（1∶1 000）抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入相應(yīng)二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，凝膠成像系統(tǒng)成像，以β-actin為內(nèi)參，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白相對表達量。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行分析，GraphPad Prism7.0軟件繪制生長曲線，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，兩組間比較行t檢驗，多組間比較及進一步兩兩比較分別行單因素方差分析和SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-138-5p在肺腺癌組織與細胞中表達下調(diào)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-138-5p在肺腺癌組織中表達水平低于癌旁組織（P＜0.05），肺腺癌H1299、HCC827、A549、H1975細胞中miR-138-5p表達水平低于BEAS-2B細胞，見圖1，其中H1299細胞中表達水平最低，選擇H1299細胞用于后續(xù)實驗。

圖1 miR-138-5p在肺腺癌組織與細胞中的表達

2.2 miR-138-5p與PD-L1靶向關(guān)系驗證 經(jīng)數(shù)據(jù)庫（genecards）在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p與PD-L1 mRNA 3’UTR區(qū)有結(jié)合位點（圖2）。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，miR-138-5p mimics和miRNC分別與野生型PD-L1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H1299細胞后，與miR-NC組相比，miR-138-5p mimics組熒光素酶活性顯著降低，見圖3，證明miR-138-5p與PD-L1存在靶向關(guān)系。

圖2 miR-138-5p與PD-L1靶向關(guān)系驗證

2.3過表達miR-138-5p對H1299細胞增殖、遷移、EMT及PD-L1表達的影響Control組和miR-NC組H1299細胞增殖、劃痕愈合率及PD-L1、PCNA、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與miR-NC組相比，miR-138-5p mimics組H1299細胞增殖、劃痕愈合率及PD-L1、PCNA、MMP-9、N-cadherin蛋白表達水平降低，miR-138-5p、E-cadherin表達水平升高，見表1和圖3。

圖3 過表達miR-138-5p對H1299細胞增殖、遷移、EMT的影響

表1 過表達miR-138-5p對H1299細胞增殖、遷移、EMT的影響 ，n=6

表1 過表達miR-138-5p對H1299細胞增殖、遷移、EMT的影響 ，n=6

與miR-NC組比較，aP＜0.05。

2.4抑制PD-L1表達對H1299細胞增殖、遷移及EMT的影響H1299細胞轉(zhuǎn)染si-PD-L1質(zhì)粒后，Control組和si-NC組H1299細胞增殖、劃痕愈合率及PD-L1、PCNA、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與si-NC組相比，si-PD-L1組H1299細胞增殖、劃痕愈合率及PDL1、PCNA、MMP-9、N-cadherin蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白表達水平升高，見表2和圖4。

圖4 抑制PD-L1表達對H1299細胞增殖、遷移及EMT的影響

表2 抑制PD-L1表達對H1299細胞增殖、遷移及EMT的影響 ，n=6

表2 抑制PD-L1表達對H1299細胞增殖、遷移及EMT的影響 ，n=6

與si-NC組比較，aP＜0.05。

2.5過表達PD-L1可逆轉(zhuǎn)過表達miR-138-5p對H1299細胞增殖、遷移及EMT的抑制作用將PDL1過表達質(zhì)粒與miR-138-5p mimics質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H1299細胞后，與miR-138-5p mimics+pcDNA組相比，miR-138-5p mimics+PD-L1組H1299細胞增殖、劃痕愈合率及PD-L1、PCNA、MMP-9、N-cadherin蛋白表達水平升高，E-cadherin蛋白表達水平降低，表明過表達PD-L1可部分逆轉(zhuǎn)過表達miR-138-5p對H1299細胞增殖、遷移及EMT的抑制作用，見表3和圖5。

圖5 同時過表達miR-138-5p與PD-L1對H1299細胞增殖、遷移及EMT的影響

表3 同時過表達miR-138-5p與PD-L1對H1299細胞增殖、遷移及EMT的影響 ，n=6

表3 同時過表達miR-138-5p與PD-L1對H1299細胞增殖、遷移及EMT的影響 ，n=6

與miR-138-5p mimics+pcDNA組相比，aP＜0.05。

3 討論

miRNAs可作為致癌基因或抑癌基因參與調(diào)控肺腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移或腫瘤細胞耐藥性等過程，與肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其中miR-138-5p在多種腫瘤中表達下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用，如miR-138-5p在胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤中低表達，調(diào)控腫瘤細胞的侵襲、遷移與腫瘤耐藥性[9-11]。已有研究顯示，miR-138-5p在肺癌中表達下調(diào)，過表達miR-138-5p可靶向叉頭框蛋白C1（FOXC1）抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[12]。本研究結(jié)果亦顯示，miR-138-5p在肺腺癌組織與細胞中表達下調(diào)。EMT是惡性腫瘤細胞發(fā)生局部浸潤與遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵；N-cadherin為上皮細胞標(biāo)志物，其水平升高有利于血管形成及上皮—間質(zhì)細胞的遷移；E-cadherin可維持細胞間極性，抑制細胞的遷移，二者在EMT過程中發(fā)揮重要作用，而MMP-9可誘導(dǎo)EMT[13]。為探索miR-138-5p對肺癌細胞的影響，本研究將miR-138-5p過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1299細胞發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-138-5p mimics組H1299細胞增殖、劃痕愈合率及PCNA、MMP-9、N-cadherin蛋白表達水平降低，miR-138-5p、E-cadherin表達水平升高。表明過表達miR-138-5p可抑制H1299細胞增殖、遷移及EMT，提示miR-138-5p在肺腺癌發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用。魏麗等[13]研究表明，眼葡萄膜黑色素瘤細胞中，過表達miR-138-5p可靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子4（TCF4）表達，從而抑制細胞增殖、侵襲及EMT。

PD-L1屬于一種負(fù)性共刺激分子，為PD-1配體，在免疫細胞、上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞均有表達，PD-L1與PD-1結(jié)合，下調(diào)淋巴細胞增殖，導(dǎo)致其效應(yīng)T細胞凋亡，發(fā)生腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤生長[14]。研究顯示，PD-L1在肝癌、胃癌、肺腺癌中的表達上調(diào)，與腫瘤的免疫耐受和免疫逃逸發(fā)生密切相關(guān)[15-16]。研究顯示，PD-L1在肺腺癌組織中呈高表達，與疾病分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和CD8+T淋巴細胞相關(guān)[17]。研究表明，在結(jié)腸癌細胞中，過表達miR-138-5p可靶向抑制PD-L1表達，抑制細胞增殖，且在體內(nèi)可抑制小鼠腫瘤的生長[18]。本研究雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-138-5p與PD-L1存在靶向關(guān)系，且在H1299細胞中，miR-138-5p的上調(diào)可抑制PD-L1表達，進一步證實二者的靶向關(guān)系。本研究通過在H1299細胞中轉(zhuǎn)染si-PD-L1質(zhì)粒下調(diào)PD-L1表達后，H1299細胞增殖、劃痕愈合率及PD-L1、PCNA、MMP-9、N-cadherin蛋白表達水平降低，E-cadherin表達水平升高，表明抑制PD-L1表達可顯著抑制H1299細胞增殖、遷移和EMT。而過表達PD-L1可部分逆轉(zhuǎn)過表達miR-138-5p對H1299細胞增殖、遷移與EMT的抑制作用。以上這些結(jié)果表明，過表達miR-138-5p可通過靶向抑制PD-L1表達，抑制H1299細胞增殖、遷移與EMT。

綜上所述，miR-138-5p在肺腺癌組織與細胞中表達下調(diào)，過表達miR-138-5p可通過靶向抑制PDL1表達而抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移和EMT。本研究僅對相關(guān)機制進行了初步研究，其涉及的相關(guān)分子通路仍需進一步研究。