徐 晶, 白 凈

(陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科, 陜西 西安 710068)

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)常用血管重建方法之一，能快速疏通狹窄或閉塞冠狀動(dòng)脈管腔，改善心肌血流灌注。但PCI后即使規(guī)范用藥仍有較高幾率出現(xiàn)支架內(nèi)再狹窄，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。新生動(dòng)脈粥樣硬化(neo atherosclerosis，NAS)是第二代藥物洗脫支架后支架內(nèi)再狹窄和支架晚期治療失敗最重要病理機(jī)制，與血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMS)增殖、遷移密切相關(guān)[1,2]。微小RNA(microRNAs，miRNA)參與多種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控，能通過調(diào)控VSMS增殖、遷移促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生發(fā)展[3]。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一種多功能蛋白，研究報(bào)道其能抑制VSMS增殖、遷移，參與AS病理發(fā)展過程[4]。本研究旨在分析ACS患者血清miR-647，PTEN水平變化，探討二者與PCI后支架內(nèi)再狹窄的關(guān)系，以前為臨床早期防治提供參考。

1 材料與方法

1.1研究對象:選取2019年1月至2020年5月我院收治的209例接受PCI的ACS患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《急性冠脈綜合征急診快速診治指南》[5]ACS診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次確診，發(fā)病至就診時(shí)間<24h；③具備PCI指征；④年齡18～<80歲；⑤臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往血管旁路手術(shù)治療或PCI史；②近期接受外科手術(shù)治療者；③不能接受隨訪者；④合并惡性腫瘤者；⑤肝、腎等重要臟器功能損害者；⑥先天性心臟病者；⑦合并免疫、血液系統(tǒng)疾病者；⑧合并急慢性感染者。本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑:PCR擴(kuò)增儀購自賽默飛世爾科技公司；Trizol試劑盒購自北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司；Takara和qPCR試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；PTEN試劑盒：北京百奧萊博科技有限公司。

1.3方 法

1.3.1基礎(chǔ)資料收集:收集患者基礎(chǔ)資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史、飲酒史、病史、病變支數(shù)、支架數(shù)量、支架內(nèi)徑、支架長度、Killip分級(分為Ⅰ～Ⅳ級)、Gensini積分(總分為冠脈狹窄程度計(jì)分×病變部位計(jì)分)和PCI術(shù)后次日空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。

1.3.2血清miR-647，PTEN水平檢測:采集患者PCI術(shù)后次日清晨空腹靜脈血，3000rpm/min離心20min (半徑8cm)，取上清存于-80℃冰箱中至檢測。部分血清使用Trizol試劑盒提取總RNA，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。miR-647上游引物：5'-GTGTTGGCCTGTGGCTG-3'，下游引物：5'-CTGACCCTCCCTCCTGC-3'；內(nèi)參U6上游引物：5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。20μL反應(yīng)體系：2μL cDNA模板、1μL引物、10μL qPCR Master Mix、6μL RNase-Free ddH2O；反應(yīng)條件：95℃ 10min (1個(gè)循環(huán))，95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s (40個(gè)循環(huán))。目標(biāo)基因血清相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。部分血清使用ELISA檢測PTEN水平，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3支架內(nèi)再狹窄判定:支架內(nèi)再狹窄定義為冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)支架兩端和/或全程5mm節(jié)段內(nèi)管腔丟失，管腔狹窄程度≥50%[6]。所有患者PCI后均隨訪1年，根據(jù)是否發(fā)生支架內(nèi)再狹窄分為再狹窄組和無再狹窄組。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者基礎(chǔ)資料比較:隨訪1年，209例ACS患者PCI術(shù)后1年共出現(xiàn)45例支架內(nèi)再狹窄，發(fā)生率為21.53%(45/209)。再狹窄組支架內(nèi)徑小于無再狹窄組，支架長度長于無再狹窄組，HDL-C水平低于無再狹窄組，Gensini積分高于無再狹窄組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者基礎(chǔ)資料比較±s，n(%)]

2.2兩組患者血清miR-647，PTEN水平比較及相關(guān)性:與無再狹窄組比較，再狹窄組血清miR-647顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.02±0.25 vs.0.79±0.20，t=6.635，P<0.001)；PTEN顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2.38±0.85 vs.3.52±1.13，t=-6.291，P<0.001)。ACS患者血清miR-647與PTEN水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.701，P<0.001)。見圖1。

圖1 血清miR-647與PTEN水平的線性散點(diǎn)圖

2.3ACS患者PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄影響因素的多因素Logistic回歸分析:以支架內(nèi)徑、支架長度、HDL-C，Gensini積分、miR-647，PTEN為自變量，PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄(是=1，否=0)為因變量，支架內(nèi)徑、PTEN為PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄獨(dú)立保護(hù)因素，Gensini積分、miR-647為獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

表2 ACS患者PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.4血清miR-647，PTEN水平對ACS患者PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的預(yù)測價(jià)值:miR-647+PTEN預(yù)測ACS患者PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的AUC大于各指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測(Z=2.971、2.521，P=0.003、0.012)。見表3、圖2。

圖2 血清miR-647，PTEN水平預(yù)測ACS患者PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的ROC曲線

表3 血清miR-647 PTEN水平對ACS患者PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的預(yù)測價(jià)值

3 討 論

目前隨著全國各地的ACS區(qū)域協(xié)同救治體系的逐漸完善，極大的降低了ACS死亡率，但PCI后支架內(nèi)再狹窄仍然是一個(gè)難題。NAS指支架術(shù)后新生內(nèi)膜組織中迅速聚集富含泡沫的巨噬細(xì)胞，伴或不伴鈣化和/或壞死核心，VSMS是血管壁中層最豐富的細(xì)胞類型，在某些應(yīng)激條件下分化、增殖、遷移能促進(jìn)壞死脂質(zhì)核心和纖維帽形成，在AS發(fā)生發(fā)展及血栓形成中發(fā)揮重要作用[7]。

miRNA是一組非編碼小分子RNA，能抑制靶miRNA翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，近年研究表明，miRNA能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)、VSMS、血管內(nèi)皮細(xì)胞等途徑參與PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄發(fā)生[8]。miR-647位于染色體20q13.33，已被認(rèn)為一系列癌癥的腫瘤抑制因子。長鏈非編碼RNA- APPAT(LncRNA APPAT)與AS形成和冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄有關(guān)，近年研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后VSMS和循環(huán)中miR-647表達(dá)均上調(diào)，且與LncRNA APPAT表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-647可能參與AS發(fā)展[3]。本研究結(jié)果顯示，再狹窄組血清miR-647表達(dá)升高，是導(dǎo)致PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，分析與miR-647能促進(jìn)VSMS增殖、遷移參與NAS形成有關(guān)。Xu等[9]使用氧化型低密度蛋白處理人主動(dòng)脈VSMC建立體外AS模型發(fā)現(xiàn)，miR-647表達(dá)上調(diào)，敲低miR-647能抑制VSMC增殖、遷移。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路廣泛調(diào)控細(xì)胞增殖、黏附、分化、遷移、凋亡等功能，該信號通路異?；罨c細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，也能通過促進(jìn)VSMS增殖、遷移參與AS進(jìn)展[10]。PTEN不僅是一種多功能蛋白，還是分化的VSMS表型的一個(gè)重要調(diào)節(jié)劑，研究發(fā)現(xiàn)VSMS脫落正常生長抑制機(jī)制后，其內(nèi)PTEN活性喪失，敲除小鼠動(dòng)脈中膜和內(nèi)膜中PTEN后能加速AS進(jìn)展[11]。研究表明，PTEN的去磷酸化作用能使磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路去磷酸化，進(jìn)而抑制該通路的活性，通過上述途徑抑制AS進(jìn)展[12]。本研究結(jié)果顯示，再狹窄組血清PTEN水平降低，是PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的獨(dú)立保護(hù)因素，說明PTEN參與PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄發(fā)生，考慮與PTEN能抑制VSMS增殖、遷移抑制NAS形成有關(guān)。本研究顯示，ACS患者血清miR-647與PTEN水平呈負(fù)相關(guān)，說明二者可能共同參與支架內(nèi)再狹窄發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN為miR-647的直接靶點(diǎn)，AS模型中PTEN能靶向抑制PTEN上調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路活性，促進(jìn)VSMS增殖、遷移。ROC曲線結(jié)果表明，血清miR-647，PTEN水平均可作為ACS患者PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的預(yù)測指標(biāo)，聯(lián)合檢測血能提高支架內(nèi)再狹窄的預(yù)測能效。

綜上所述，PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄ACS患者血清miR-647水平升高，PTEN水平降低，二者可能共同參與支架內(nèi)再狹窄，可作為支架內(nèi)再狹窄預(yù)測指標(biāo)。但研究僅限于觀察血清水平變化，未進(jìn)一步分析二者參與支架內(nèi)再狹窄中的機(jī)制。