許 帆， 沈 燕， 張 霞

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院乳腺科， 上海 200093)

乳腺癌指起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是全球女性最常見同時死亡率最高的惡性腫瘤，最新數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌發(fā)病率和死亡率分別為58.5/10萬、17.7/10萬[1]。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其組織形態(tài)、免疫表型、治療反應(yīng)等存在極大差異，盡管近年來乳腺癌的治療取得較大進(jìn)展，其預(yù)后相對較好，但晚期乳腺癌患者5年生存率仍然不足20%[2]。深入研究乳腺癌分子機(jī)制，對改善患者預(yù)后具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類短鏈非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)靶基因的負(fù)向調(diào)控，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。miR-4732-5p是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，研究報(bào)道其在乳腺癌組織中高表達(dá)，可作為乳腺癌診斷生物標(biāo)志物[3]。四跨膜蛋白13(tetraspanin 13，TSPAN13)是TSPAN超家族一員，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移等一系列生物過程，研究報(bào)道TSPAN13在乳腺癌細(xì)胞株中呈低表達(dá)，能抑制乳腺癌增殖、分化、遷移等行為[4]。但關(guān)于乳腺癌組織中miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系尚不明確，基于此本研究報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:收集2016年1月至2018年8月于我院住院的105例乳腺癌患者手術(shù)標(biāo)本，包括癌組織和距離>5cm的癌旁組織，新鮮組織獲取后立即分裝于凍存管中置放入液氮保存。年齡32～78(50.25±5.68)歲；腫瘤部位：49例左側(cè)，56例右側(cè)；腫瘤直徑：49例≥4cm，56例<4cm；病理類型：45例浸潤性癌，60例非浸潤性癌；雌激素受體：76例陽性，29例陰性；孕激素受體：60例陽性，45例陰性；分化程度：43例低分化，62例中高分化；TNM分期：51例Ⅰ～Ⅱ期，54例Ⅲ～Ⅳ期；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：49例轉(zhuǎn)移，56例無轉(zhuǎn)移。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為宮頸癌；②初診，未接受任何抗腫瘤治療；③女性；④病理資料和隨訪資料完整；⑤患者及家屬均知情研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤；②年齡<18歲；③嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾病者；④全身感染性疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法:取出液氮凍存組織，轉(zhuǎn)至無RNase的EP管，每30～50mg組織加入1mL Trizol裂解，提取組織總RNA，BioPhotometer plus 核酸蛋白測定儀測定總DNA濃度及純度，使OD260/OD280為1.8～2.0，Takara試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。miR-4732-5p上游引物：5′-GATCTGGATTGATATCAT-3′，下游引物：5′-TTCGAATGAGGACTAATA-3′；TSPAN13上游引物：5′-AACGCTGGCTCCGAAAACTT-3′，下游引物：5′-CCTAAGGCGGTAAAATGCC-3′；miR-4732-5p內(nèi)參U6上游引物：5′-TTACTGATTCGCTAGCAT-3′，下游引物：5′-CCGATTCTACGCTCGTGA-3′；TSPAN13內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GGCTACAGCAACAGGGTG-3′，下游引物：5′-TTTGGTTGAGCACAGGGT-3′。反應(yīng)體積共20μL：10μL 2×All-in-One qPCR Mix；2μL上游、下游引物；2μL cDNA模板；4μL經(jīng)DEPC處理水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min循環(huán)1次，95℃變性10s、60℃退火20s、延伸72℃ 10s循環(huán)40次，反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管Ct，構(gòu)建溶解曲線，采用2-ΔΔCt法計(jì)算組織中miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA相對表達(dá)量。

1.3隨訪:患者出院后通過門診或電話方式隨訪3年，隨訪至2021年8月，統(tǒng)計(jì)術(shù)后3年累積生存率，累積生存率定義為治療后至任何原因死亡或隨訪截止。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌組織與癌旁組織中miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表達(dá)比較:乳腺癌組織中miR-4732-5p表達(dá)(1.131±0.273)高于癌旁組織(0.629±0.169)，TSPAN13 mRNA表達(dá)(0.355±0.078)低于癌旁組織(0.529±0.081)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.019、-15.790，P均<0.001)。

2.2乳腺癌組織中miR-4732-5p與TSPAN13 mRNA表達(dá)的相關(guān)性:生物學(xué)軟件TargetScan Release 7.2預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TSPAN13與miR-4732-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，Pearson相關(guān)性分析顯示，乳腺癌組織中miR-4732-5p與TSPAN13 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.732，P<0.001)。見圖1和圖2。

圖1 miR-4732-5p與TSPAN13結(jié)合位點(diǎn)示意圖

圖2 乳腺癌組織中miR-4732-5p與TSPAN13 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.3乳腺癌組織中miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性ER陽性:miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表達(dá)與乳腺癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、雌激素受體、孕激素受體無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 乳腺癌組織中miR-4732-5p TSPAN13 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性±s)

2.4miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表達(dá)與乳腺癌患者生存率的關(guān)系:中位隨訪28個月，105例乳腺癌患者累積生存率為87.62%(92/105)，以miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表達(dá)均值為基準(zhǔn)分為高低表達(dá)組。高miR-4732-5p表達(dá)組(≥1.131，n=54)和低miR-4732-5p表達(dá)組(<1.131，n=51)累積生存率分別為81.48%(44/54)、94.12%(48/51)，高TSPAN13 mRNA表達(dá)組(≥0.355，n=57)和低TSPAN13 mRNA表達(dá)組(<0.355，n=48)累積生存率分別為92.98%(53/57)、81.25%(39/48)。高miR-4732-5p表達(dá)組累積生存率低于低miR-4732-5p表達(dá)組，高TSPAN13 mRNA表達(dá)組累積生存率高于低TSPAN13 mRNA表達(dá)組(Log-rank χ2=4.700、3.961，P=0.030、0.047)。見圖3。

圖3 不同miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表達(dá)乳腺癌患者K-M生存曲線

2.5乳腺癌患者預(yù)后不良影響因素的單因素及多因素Cox回歸分析:以隨訪時間為時間變量，單因素分析有差異因素為自變量，預(yù)后(死亡=1，存活=0)為因變量，多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-4732-5p≥1.131為乳腺癌患者預(yù)后不良獨(dú)立風(fēng)險因素，TSPAN13 mRNA≥0.355為獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見表2和表3。

表2 乳腺癌患者預(yù)后不良影響因素的單因素分析

表3 乳腺癌患者預(yù)后不良影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討 論

乳腺癌主要由乳腺上皮細(xì)胞增殖失控進(jìn)而惡變形成，近年來分子生物學(xué)發(fā)展為腫瘤治療提供了新的途徑，但乳腺癌在基因水平上的治療仍然缺乏有力證據(jù)，特別是三陰性晚期乳腺癌，抗人表皮生長因子受體2治療后總體生存率仍然未獲得明顯改善，進(jìn)一步探索乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)機(jī)制，對延長乳腺癌患者生存時間意義重大[5]。

miRNA是一類內(nèi)源性長約18～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，主要通過降解靶mRNA或阻礙靶蛋白翻譯而調(diào)控靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)育、分化、遷移等多種生物學(xué)過程。miR-4732-5p是一種新近發(fā)現(xiàn)的miRNA，近期幾項(xiàng)研究報(bào)道m(xù)iR-4732-5p與人類腫瘤的關(guān)系，如miR-4758-3p在胃癌組織和卵巢癌患者血清中高表達(dá)，分別與胃癌輔助化療后復(fù)發(fā)和卵巢癌發(fā)生有關(guān)[6,7]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-4732-5p表達(dá)升高，且與患者分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明miR-4732-5p表達(dá)升高參與乳腺癌惡性進(jìn)展，其機(jī)制可能與miR-4732-5p能下調(diào)p53有關(guān)。p53是一種腫瘤抑制基因，能阻止DNA突變或受損細(xì)胞分裂并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞傳導(dǎo)凋亡信號，阻止腫瘤形成[8]。Pouladi等[9]研究顯示，miR-4732-5p能通過阻斷WD40編碼的p53 RNA反義轉(zhuǎn)錄子/p53混合物形成下調(diào)p53濃度。

TSPAN超家族是一組分子量為20～50kDa的糖蛋白，其四次跨膜結(jié)構(gòu)能聯(lián)系膜內(nèi)、跨膜和膜外蛋白，連接膜內(nèi)外信號通道功能，并促進(jìn)信號網(wǎng)絡(luò)中結(jié)合蛋白質(zhì)的相互作用，參與細(xì)胞多種生命活動[10]。Li等[11]研究顯示，TSPAN13 在甲狀腺癌中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)能促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖和抑制凋亡。Jaiswal等[12]研究報(bào)道，TSPAN13在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)能促進(jìn)骨肉瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和抑制凋亡。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中TSPAN13 mRNA表達(dá)降低，且與患者分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示TSPAN13在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究結(jié)果還顯示，miR-4732-5p高表達(dá)與TSPAN13 mRNA低表達(dá)乳腺癌患者3年累積生存率明顯降低，二者均為乳腺癌患者預(yù)后不良獨(dú)立影響因素，說明miR-4732-5p和TSPAN13可成為評估乳腺癌預(yù)后的標(biāo)志物。生物學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TSPAN13的3’-非翻譯區(qū)域含有miR-4732-5p的結(jié)合位點(diǎn)，相關(guān)性分析也證實(shí)乳腺癌組織中miR-4732-5p與TSPAN13 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明二者可能共同參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展。Wang等[13]通過熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)，miR-4732-5p能靶向下調(diào)TSPAN13促進(jìn)乳腺癌增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-4732-5p表達(dá)上調(diào)，TSPAN13 mRNA表達(dá)下調(diào)，與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能成為乳腺癌患者預(yù)后評估生物標(biāo)志物。但本研究樣本量較少，隨訪時間較短，關(guān)于miR-4732-5p、TSPAN13參與乳腺癌的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。