吳偉川， 門東海， 劉磊峰， 梁興波， 陳銀慧， 李承燕

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院， 廣東 湛江 524000)

膠質(zhì)瘤作為神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腦腫瘤，患有此病的患者預(yù)后極差，盡管近幾年治療手段不斷提升，但5年的整體生存率仍不理想[1]?，F(xiàn)階段膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制已證實(shí)與原癌基因的異常激活和抑癌基因的失活相關(guān)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。非編碼RNA(ncRNA)特別是長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)lncRNA已證實(shí)在膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2,3]。近年來研究指出小核仁RNA宿主基因15(Small nucleolar RNA host gene 15，SNHG15)在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，但具體機(jī)制仍未闡明[4]。本研究探討SNHG15- miR-451a調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料:人腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系HEB(永生細(xì)胞)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87、U251和Hs683)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。增殖細(xì)胞核抗原(PNCA，1∶100稀釋使用)購自美國Invitrogen公司及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國beyotime公司。Lipofectamine 3000試劑盒購自美Thermo公司，DeadEndTM 熒光測定TUNEL系統(tǒng)購自Promega公司，TRIZOL購自美國Invitrogen公司及PrimeScriptTMRT reagent Kit購自中國Takara公司。0.25%胰酶Trypsin-EDTA、四氮唑藍(lán)(MTT)、EDTA、PS(青霉素+鏈霉素)、DMEM、二氯乙酸鈉(DAC)及二甲基亞礬(DMSO)等均購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自Gibco公司。全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BIO-RAD550)、Real-time PCR儀及熒光顯微鏡購自美國BIO-RAD公司。

1.2方 法

1.2.1研究樣本采集:本研究選用的臨床組織標(biāo)本收集于廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院20例膠質(zhì)瘤患者(男12例，平均年齡52.2±7.5歲；女8例，平均年齡47.4±6.8歲)。在知情同意的情況，經(jīng)手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本及癌旁組織(大于3cm)，研究涉及所有組織樣本均得到了本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選用U87細(xì)胞進(jìn)行研究。轉(zhuǎn)染前24h，將U87細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種到6孔板，使用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000 試劑分別將 SNHG15 小干擾 RNA(siRNA)、陰性對照序列(NC)、miR-141 抑制劑(miR-141 inhibitor)對U87細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染陰性對照序列(siNC)組、轉(zhuǎn)染 SNHG15 siRNA (siSNHG15)組、轉(zhuǎn)染SNHG15 siRNA和 miR-141 inhibitor(siSNHG15+miR-451a inhibtor)組。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.3RNA 提取及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):使用Trizol從細(xì)胞系或組織中提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA的含量，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA合成cDNA，根據(jù)qRT-PCR試劑盒制造商指示，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。SNHG15：正向引物 5'-CAACCATAGCGGTGCAACTGTGC-3'，反 向 引 物 3'-GGCTGAACCAAGTTGCAAGTCATG-5'。SNHG15內(nèi)參GAPDH ：正向引物 5'-CAGTGCCAGCCTCGTCTA T-3'，反向引物：3'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC- 5'。miR-451a的正向引物序列為5'-GGTGGTGAATACCCTCCTG-3'；反向引物序列為5'-GTCTGTCCGTGGTGCTGA-3'。miR-451a 內(nèi)參 U6 ：正向引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，反向引物3'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5'。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△CT值形式得到。每組設(shè)置 5 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):構(gòu)建SNHG15的的野生型和突變質(zhì)粒。分別提取SNHG15-WT和SNHG15-Mut的質(zhì)粒，與miR-451a inhibtor共同轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞。然后上機(jī)檢測熒光素酶的活性。

1.2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染后，收集各組細(xì)胞，Matrigel凝膠于4℃條件下過夜，次日Matrigel 膠對 Transwell 小室進(jìn)行預(yù)包被，將細(xì)胞調(diào)整為1×106個(gè)/mL。在上室加入100μL 細(xì)胞懸液；在下室加入600μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基；隨后恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。將小室置于95%乙醇中固定 5 min；在0.5%結(jié)晶紫染色液中染色10min后，用棉簽輕拭去小室濾膜上層的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察濾膜下層細(xì)胞。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):收集每組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并再次在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到約90%時(shí)，使用垂直于6孔板底部的200μL移液管吸頭進(jìn)行水平劃線。24h后使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，使用Image J軟件測量劃痕的寬度。

1.2.7Tunel實(shí)驗(yàn):在4%多聚甲醛中固定各組U87細(xì)胞30～60 min，在0.3% H2O2中孵育(37℃，20 min)，PBS洗滌3次。加50μL生物素標(biāo)記液孵育(37℃，60 min)。用PBS洗滌1次，滴加0.1-0.3mL標(biāo)記反應(yīng)終止液，37℃孵育10min，加50μL Streptavidin-HRP工作液，37℃，30 min，滴加0.2-0.5mL DAB顯色液，用蘇木素染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色。用95%乙醇脫水5 min，隨后100%乙醇脫水2次(3 min/次)，最后甲苯透明 2次(5 min/次)，顯微鏡下觀察切片。

1.2.8體內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原:選取BALB/c裸鼠20只，所有裸鼠隨機(jī)分為siNC組、 siSNHG15組、NC inhibtor組、miR-451a inhibtor組和siSNHG15+miR-451a inhibtor組及對照組，每組4只。轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞，然后配置成濃度約為1×107個(gè)/mL單細(xì)胞懸液并按0.2mL/只接種到對應(yīng)小鼠左前上肢腋部皮下。21d后處死5組小鼠，剝離瘤體稱重，選取組織切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1檢測臨床組織標(biāo)本和細(xì)胞系中SNHG15和miR-451a的表達(dá)量:通過LncExpDB和GeneCards數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SNHG15定位于染色體7p13上，且在多種疾病和腫瘤中呈現(xiàn)表達(dá)差異，包括膠質(zhì)瘤(圖1.A)。采用qRT-PCR檢測SNHG15在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，SNHG15在膠質(zhì)瘤組織中(2.85±0.43)表達(dá)高于癌旁組織(1.12±0.31)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)SNHG15表達(dá)量在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87、U251、Hs683)(3.14±0.36，2.24±0.21，1.85±0.19)中均高于HEB細(xì)胞(1.08±0.11)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1.B)。通過TargetScan數(shù)據(jù)庫，找到miR-451a相關(guān)信息和莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1.C)。miR-451a在膠質(zhì)瘤組織中(0.45±0.14)表達(dá)低于癌旁組織(0.98±0.22)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而miR-451a表達(dá)量在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87、U251、Hs683)(0.41±0.09；0.55±0.11；0.72±0.13)中均低于HEB細(xì)胞(1.05±0.19)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1.D)。

圖1 檢測臨床組織樣本和細(xì)胞系中SNHG15和miR-451a的表達(dá)量(A，C)SNHG15和miR-451a基本生物信息。(B)SNHG15在臨床組織樣本及細(xì)胞系中表達(dá)水平。(D)miR-451a在臨床組織樣本及細(xì)胞系中表達(dá)水平。(**，表示P<0.05)

2.2ceRNA調(diào)控機(jī)制:通過ENCORI和LncRNABase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)miR-451a與SNHG15存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2.A)。然后將SNHG15或miR-451a inhibitor質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)U87細(xì)胞后,驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功(圖2.B)。在U87細(xì)胞中，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-451a inhibitor后SNHG15熒光素酶活性增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而對SNHG15的突變型質(zhì)粒連接的熒光素酶活性無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2.C)。采用Pull down生物素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-451a降低U87細(xì)胞中SNHG15的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2.D)；而U87細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SNHG15質(zhì)粒后miR-451a水平表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2.E)。這些結(jié)果提示SNHG15作為ceRNA，與miR-451a之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系并競爭性結(jié)合。

圖2 ceRNA調(diào)控機(jī)制(A)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-451a與SNHG15存在結(jié)合位點(diǎn)。(B)檢測敲低SNHG15和miR-451a inhibitor轉(zhuǎn)染成功。(C)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測SNHG15熒光素酶活性。(D，E)Pull down和qRT-PCR檢測SNHG15和miR-451a調(diào)控機(jī)制。(**，表示P<0.05)

2.3U87細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控情況:通過Tranwell細(xì)胞侵襲、細(xì)胞劃痕及Tunel細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)(圖3)，發(fā)現(xiàn)抑制SNHG15表達(dá)后U87細(xì)胞侵襲和遷移距離及細(xì)胞凋亡率降低；而轉(zhuǎn)染miR-451a inhibitor后U87細(xì)胞的侵襲和遷移距離及細(xì)胞凋亡率均增加。

圖3 U87細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控情況Tranwell侵襲實(shí)驗(yàn)，Scale bar=25 μm，×400倍鏡；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，Scale bar=150 μm，×100倍鏡；Tunel細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。Scale bar=20 μm，×500倍鏡。

2.4皮下腫瘤生長及體內(nèi)細(xì)胞增殖情況:構(gòu)建膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤模型，對皮下腫瘤生長情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示SNHG15組移植瘤重量較NC組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4.A)，而miR-451a組移植瘤重量較miR-NC組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4.B)。采用多組增殖細(xì)胞核抗原PCNA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，siSNHG15組PCNA表達(dá)低于siNC組及siSNHG15+miR451a inhibitor組，而轉(zhuǎn)染miR-451a inhibitor則降低siSNHG15的抑制PCNA表達(dá)作用(圖4.C)；miR-451a inhibitor組PCNA表達(dá)高于NC inhibitor組及siSNHG15+miR451a inhibitor組，而共轉(zhuǎn)染siSNHG15及miR-451a inhibitor后，抑制了 miR-451a促進(jìn)PCNA表達(dá)作用(圖4.D)。

圖4 皮下腫瘤生長及體內(nèi)細(xì)胞增殖情況(A，B)各組皮下移植瘤重量比較。(C，D)增殖細(xì)胞核抗原PCNA實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況，Scale bar=50μm，×200倍鏡。(**，表示P<0.05)

3 討 論

近年來，有關(guān)lncRNA在膠質(zhì)瘤中的研究越來越多，SNHG15在lncRNA家族中也占據(jù)重要位置，已證實(shí)與多種癌癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)[5]。Li等研究顯示LncRNA-SNHG15通過抑制miR-338-3p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[6]；Dong等研究顯示長鏈非編碼RNA SNHG15可影響非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良，促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲[7]；但關(guān)于SNHG15與膠質(zhì)瘤相關(guān)報(bào)道甚少，具體調(diào)控機(jī)制更加不清楚，本研究就此開展深入研究。

Li的研究團(tuán)隊(duì)曾通過公共數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，SNHG15在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞中上調(diào)，并與GBM患者的不良預(yù)后相關(guān)[8]。與以往研究結(jié)果類似，本研究中，通過LncExpDB和GeneCards數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SNHG15定位于染色體7p13上，且在多種疾病和腫瘤中呈現(xiàn)表達(dá)差異，包括膠質(zhì)瘤。本研究檢測發(fā)現(xiàn)SNHG15在20例膠質(zhì)瘤患者組織樣本和細(xì)胞系中均呈高表達(dá)，同時(shí)還能促進(jìn)皮下腫瘤生長。這些結(jié)果說明，SNHG15在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，同時(shí)以何種調(diào)控機(jī)制參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤惡性生物學(xué)行為，是影響腫瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，為了進(jìn)一步了解SNHG15在膠質(zhì)瘤中的工作機(jī)制，研究SNHG15對膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。本研究發(fā)現(xiàn)敲低SNHG15能有效的抑制U87細(xì)胞侵襲和遷移，促進(jìn)凋亡，且抑制體內(nèi)細(xì)胞增殖。這些發(fā)現(xiàn)說明敲低SNHG15可能對抗膠質(zhì)瘤產(chǎn)生一定調(diào)控作用。

關(guān)于lncRNA調(diào)控機(jī)制，lncRNA可以根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原理與DNA和RNA相互作用，研究顯示膠質(zhì)瘤lncRNA被證實(shí)可通過ceRNA機(jī)制調(diào)控miRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展[9,10]。因此為了進(jìn)一步探究SNHG15在膠質(zhì)瘤中的作用，本研究通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-451a、SNHG15可能存在配對區(qū)域，隨后檢測發(fā)現(xiàn)miR-451a在膠質(zhì)瘤組織以及細(xì)胞中均表達(dá)明顯降低并抑制皮下腫瘤生長。然后驗(yàn)證了SNHG15與miR-451a之間的靶向關(guān)系、競爭性結(jié)合及負(fù)調(diào)控關(guān)系。體內(nèi)外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低SNHG15顯著減少了U87細(xì)胞侵襲、遷移距離、體內(nèi)增殖及促進(jìn)凋亡率增加。而miR-451a抑制物則能抵消敲低SNHG15的調(diào)控效果，且相對拉回了敲低SNHG15對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能調(diào)控的能力。這些結(jié)果提示SNHG15可能是通過競爭性結(jié)合miR-451a參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移、凋亡及體內(nèi)增殖的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SNHG15通過ceRNA機(jī)制調(diào)控miR-451a的表達(dá)，作為膠質(zhì)瘤診斷和治療潛在靶點(diǎn)的價(jià)值提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。