孫繼紅, 柳 雪, 陶亞東, 劉 慧, 霍 峰， 武俊華, 徐樹雷

(1.承德醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院， 河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000 3.河北省軍區(qū)承德離職干部休養(yǎng)所， 河北 承德 067000)

在常見的惡性腫瘤中頭頸部腫瘤排名第六位，90%為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌[1]。其中口腔舌鱗狀細(xì)胞癌(oral tongue squamous cell carcinoma，OTSCC)是最常見的口腔鱗狀細(xì)胞癌。根據(jù)腫瘤調(diào)查統(tǒng)計數(shù)據(jù)，口腔癌的5年生存率約為53%，而口腔舌鱗癌的5年生存率僅為33%～40%[2]。OTSCC通常根據(jù)臨床癥狀，淋巴結(jié)腫大和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況評估腫瘤，并進(jìn)行治療計劃分期[3]。但是這種分期系統(tǒng)不能為早期OTSCC提供準(zhǔn)確的預(yù)測。因此，我們要尋找更可靠的預(yù)后標(biāo)志物，以便更好地鑒別早期OTSCC具有侵襲性行為。證據(jù)顯示20%～40%的患者在發(fā)病前已經(jīng)有隱匿性轉(zhuǎn)移[4]。干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor,IRF)是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，該家族基因主要由IRF1-IRF9等9個成員組成。干擾素調(diào)節(jié)因子-1 (Interferon regulatory factor-1,IRF1)是IRF家族的一種腫瘤調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)干擾素的表達(dá)[5]。隨著研究的深入，IRF1在炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、T細(xì)胞分化和DNA損傷期間的基因表達(dá)調(diào)控中的功能越來越多被報道被揭示。IRF1基因改變和/或低表達(dá)與較差的臨床結(jié)果、較高的癌癥易感性和較低的免疫治療應(yīng)答有關(guān)，提示IRF1在白血病、乳腺癌、宮頸癌和結(jié)直腸癌等多種癌癥類型中具有抑癌作用[6]。然而，IRF1在肝癌和食管癌中的致癌能力最近有報道[7]。這些研究表明IRF1在癌癥中起到抑癌基因的作用，并且與癌癥類型相關(guān)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)IRF1在口腔舌鱗癌細(xì)胞中表達(dá)顯著降低。而且過表達(dá)IRF1后可以抑制口腔舌鱗癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。故此我們大膽推測IRF1在口腔舌鱗癌細(xì)胞中起到抑癌基因作用，并且進(jìn)一步探求了IRF1的上游表達(dá)調(diào)控因子，以期能夠揭示IRF1在口腔舌鱗癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，為口腔舌鱗癌細(xì)胞的早期診斷和治療提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器：(1)Tca-8113細(xì)胞:(天津賽爾生物技術(shù)有限公司);(2) IRF1過表達(dá)和敲降質(zhì)粒:(天津賽爾生物技術(shù)有限公司);(3) 胰蛋白酶：(GIBCO BRL,美國);(4) 1640培養(yǎng)基:(GIBCO BRL,美國);(5)Opti-MEM:(GIBCO BRL，美國);(6)乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2):(天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司);(7) PBS (含137 mmoL/L NaCl,2.7 mmoL/L KCl,10 mmoL/L Na2HPO4,2 mmoL/L KH2PO4);(8) 胎牛血清(FBS):(GIBCO,美國);(9)6孔,12孔,24孔培養(yǎng)板,T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶:(Orange Scientific,比利時);(10)CO2恒溫培養(yǎng)箱:(Thermo Forma,美國);(11)5415D型離心機(jī):(Eppendorf,德國);(12)TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒:(Roche,瑞士) ;(13)脂質(zhì)體Lipofectamine2000 Reagent:(Invitrogen,美國);(14)12對口腔舌鱗癌組織及其癌旁正常組織:(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科)。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染:首先進(jìn)行細(xì)胞接種，100萬個細(xì)胞接種至25mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒的質(zhì)量(μg)與脂質(zhì)體的體積比例為1∶1，配制好質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合物后，靜置20min后再加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。轉(zhuǎn)染4h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3TUNEL方法:細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h，調(diào)整細(xì)胞濃度，按照4000個/孔接種14孔板。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個副孔。待細(xì)胞貼壁后，加0.1ppc的紫杉醇誘導(dǎo)凋亡1h。處理標(biāo)志為：細(xì)胞部分變圓，部分形態(tài)正常。樣本固定：待6孔板中細(xì)胞晾干之后，每孔加入1mL新鮮配制的固定液室溫15～25℃固定細(xì)胞1h， (固定液：4%多聚甲醛溶于PH7.4 的PBS 中，新鮮配制); 漂洗；加入1mL封閉液，室溫15～25℃封閉10min；(封閉液：無水甲醇稀釋的3%H2O2)。漂洗；加入1mL通透液，冰上放置2min；(通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配制)。制作陽性對照樣本：樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后，用DNA酶1反應(yīng)液，處理30min。配制TdT酶反應(yīng)液：平衡液 45μL，熒光標(biāo)記液1μL，TdT 酶 4μL，共50μL 。標(biāo)記：漂洗2次； 標(biāo)記 60min；漂洗；染色5min。熒光顯微鏡下觀察，可以使用的激發(fā)波長范圍為450～500nm，發(fā)射波長范圍為515～565nm(綠色熒光)；凋亡指數(shù)是指每張TUNEL陽性切片選取5個陽性細(xì)胞(表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞為陽性)數(shù)最多的高倍視野(400)，計算500個舌鱗癌細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比。

1.4實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)(Real-time PCR):混勻后37℃1min，50℃ 60min，70℃ 15min。cDNA產(chǎn)物置于冰盒中待用，或-20℃保存?zhèn)溆?。①按照所需用量增加配比體積。配置比例如下：2 × Master Mix，5μL；10uM 的PCR特異引物F，0.5μL；10uM 的PCR特異引物R，0.5μL水，2μL。②加樣 取8μL混合液分別加入至每個孔中，再按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)的cDNA，2μL/孔；封膜，混勻，瞬離；置于冰板上備用。③設(shè)置如下反應(yīng)程序：95℃，8min；95℃，10s；60℃，60s；42個循環(huán)。④計算結(jié)果:收集結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置5個副孔，去掉最高值和最低值，取3個副孔的平均數(shù)，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。Folds=2-△△Ct，△△Ct=(Ct1～Ct2)-(Ct3～Ct4)

1.5MTT實(shí)驗(yàn):細(xì)胞轉(zhuǎn)染18h后，消化，計數(shù)，以每孔6000個細(xì)胞種于96孔板，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后不同天數(shù)的同一時間進(jìn)行檢測，依此加入MTT液與DMSO，然后測定A570。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置5個副孔，去掉最高值和最低值，取3個副孔的平均數(shù)。

1.6熒光報告載體實(shí)驗(yàn):通過Targetscan軟件預(yù)測到miR-23a可以與IRF1 3’UTR相結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)序列為：AATGTGA，將該序列突變?yōu)門AAGAGT。將包含結(jié)合位點(diǎn)長度為150bp的野生型和突變型IRF1 3’UTR(IRF13’UTR,IRF1 3’UTR mut)構(gòu)建到pCD3/EGFP載體中。以50nmoL/L ASO-NC,ASO-23a,或者200ng pcDNA3,pri-miR-23a和IRF13’UTR,IRF13’UTR mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)24孔板中的Tca8113細(xì)胞，并添加1.0μL Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染4h后換液；轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞進(jìn)行裂解，并利用雙熒光素酶試劑盒進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置5個副孔，去掉最高值和最低值，取3個副孔的平均數(shù)。

1.7Western blot:裂解細(xì)胞，取上清液。配制10%凝膠，上樣，分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入抗體，IRF1抗體和GAPDH抗體分別按照1∶200和1∶500的比例加入相應(yīng)的膜中，置于4℃過夜。次日洗膜后，將二抗按照1∶1000的比例加入膜中室溫作用2h。曝光，照相。用LabWorks TM凝膠成像及分析系統(tǒng)對膠片進(jìn)行攝像，軟件分析得到各組蛋白條帶亮度值，并以對照組為標(biāo)準(zhǔn)值1，繪制柱狀圖。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1IRF1在舌鱗癌組織中表達(dá)水平降低:結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，IRF1在舌鱗癌組織中表達(dá)平均下降至對照組的38%，最低下降至11%，其中有一例下降至對照組98%(圖1)。結(jié)果表明在12對舌鱗癌組織中，與癌旁組織相比，IRF1的表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 12對舌鱗癌組織中IRF1的表達(dá)水平Real-time PCR檢測舌鱗癌組織及其癌旁組織中的IRF1。

2.2IRF1 抑制舌鱗癌細(xì)胞的生長活性:由于IRF1在舌鱗癌組織中表達(dá)降低，我們構(gòu)建了IRF1的過表達(dá)質(zhì)粒，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染提升Tca8113細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。如圖2所示，過表達(dá)IRF1后，Tca8113細(xì)胞的生長活性與對照組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染后24h檢測細(xì)胞活性，過表達(dá)IRF1組下降至對照組的87%；轉(zhuǎn)染后48h檢測細(xì)胞活性，過表達(dá)IRF1組下降至對照組的75%；轉(zhuǎn)染后72h檢測細(xì)胞活性，過表達(dá)IRF1組下降至對照組的61%。上述結(jié)果表明IRF1可以抑制舌鱗癌細(xì)胞的生長活性。

圖2 IRF1對Tca8113細(xì)胞生長活性的影響在Tca8113細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IRF1過表達(dá)質(zhì)粒后，分別在24h，48h，72h應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的生長活性。

2.3IRF1促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的凋亡:基于以上結(jié)果，IRF1在舌鱗癌組織中表達(dá)異常降低，且IRF1可抑制舌鱗癌細(xì)胞的生長活性。我們應(yīng)用紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(濃度為0.1ppc)，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h加入紫杉醇，誘導(dǎo)凋亡1h，通過TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測IRF1對舌鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。如圖3A所示，過表達(dá)IRF1后，IRF1過表達(dá)組比IRF1-對照舌鱗癌細(xì)胞Tca8113的凋亡細(xì)胞明顯增加，凋亡指數(shù)由0.9%增加到8.4%(圖3B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明IRF1可以促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的凋亡。

圖3 IRF1對Tca8113細(xì)胞凋亡的影響(A)在Tca8113細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IRF1過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后加入0.1ppc紫杉醇誘導(dǎo)24h后，拍照檢測凋亡細(xì)胞數(shù)目。(B) 對視野內(nèi)的細(xì)胞計數(shù)并統(tǒng)計出凋亡指數(shù)。

2.4IRF1是miRNA-23a的直接靶基因:如圖4所示，生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-23a的種子序列可以與IRF1的3’UTR相結(jié)合。IRF1野生型的3’UTR與miR-23a有7個結(jié)合位點(diǎn)，也稱作種子序列。我們將野生型的IRF1 3’UTR構(gòu)建熒光報告質(zhì)粒pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTR。 我們將種子序列中突變了四個位點(diǎn)， 作為突變型的IRF1 3’UTR mut，構(gòu)建熒光報告質(zhì)粒pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTRmut。用于接下來的熒光報告載體實(shí)驗(yàn)。如圖5所示，我們將野生型熒光報告載體pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTR，圖中簡寫為EGFP-IRF1 3’UTR轉(zhuǎn)染進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞Tca8113中，同時過表達(dá)miR-23或封閉miR-23a，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-23a后，pri-miR-23a組比pcDNA3組熒光強(qiáng)度降低了55%；封閉miR-23a后，ASO-23a組比ASO-NC組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了1.7倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。我們將突變型的熒光報告載體pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTRmut，同時過表達(dá)或者封閉miR-23a，結(jié)果顯示，pri-miR-23a組比pcDNA3組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)1.1倍；封閉miR-23a后，ASO-23a組比ASO-NC組熒光強(qiáng)度降低至97%，兩組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上，熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-23a可以直接靶定IRF1 3’UTR野生型，并且抑制其下游的熒光基因表達(dá)，導(dǎo)致熒光表達(dá)降低。

圖4 miR-23a與IRF1mRNA3‘UTR相結(jié)合的種子序列以及突變型

圖5 熒光報告載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果構(gòu)建IRF13’UTR的野生型及突變型熒光報告載體，轉(zhuǎn)染進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞中，同時過表達(dá)或者封閉miR-23a檢測各組熒光強(qiáng)度

2.5舌鱗癌組織中miR-23a的表達(dá)水平:如圖6所示，我們用實(shí)時定量PCR檢測miR-23a的表達(dá)水平，在12對舌鱗癌組織中結(jié)果顯示，在舌鱗癌組織中miR-23a表達(dá)升高，癌組織與癌旁正常組織相比miR-23a的表達(dá)水平平均升高32.5倍，最低9.2倍，最高57.4倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，在舌鱗癌組織中miR-23a的表達(dá)水平異常升高，起致癌基因作用，促進(jìn)舌鱗癌發(fā)生發(fā)展。

圖6 miR-23a在舌鱗癌組織中的表達(dá)水平應(yīng)用real-time PCR檢測miR-23a在舌鱗癌組織中的表達(dá)水平

2.6封閉miR-23a表達(dá)后，舌鱗癌細(xì)胞活性明顯降低:上述結(jié)果顯示IRF1在舌鱗癌組織中水平異常降低，上游受miR-23a調(diào)控，在舌鱗癌組織中miR-23a表達(dá)水平升高。我們大膽推測升高的miR-23a通過靶定IRF1的3‘UTR降低了IRF1的表達(dá)水平。我們合成了miR-23a的反義寡核苷酸序列ASO-23a，以此封閉舌鱗癌細(xì)胞中異常高表達(dá)的miR-23a，無意義序列ASO-NC作為對照。將ASO-23a轉(zhuǎn)染進(jìn)Tca8113細(xì)胞后，ASO-23a與細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的miR-23a相結(jié)合，解除了miR-23a對IRF1的負(fù)性調(diào)控。我們應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測封閉miR-23a后，舌鱗癌細(xì)胞活性的改變。如圖7所示，轉(zhuǎn)染24h后檢測舌鱗癌細(xì)胞的生長活性，與ASO-NC組相比，ASO-23a組下降了14%；轉(zhuǎn)染48h后檢測舌鱗癌細(xì)胞的生長活性，與ASO-NC組相比，ASO-23a組下降了24%；轉(zhuǎn)染72h后檢測舌鱗癌細(xì)胞的生長活性，與ASO-NC組相比，ASO-23a組下降了39%(圖7)。結(jié)果表明，與ASO-NC組相比，ASO-23a組的細(xì)胞活性明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。封閉miR-23a與過表達(dá)IRF1的細(xì)胞活性檢測結(jié)果一致，都降低舌鱗癌細(xì)胞的生長活性。

圖7 封閉miR-23a后MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在Tca8113細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ASO-23a和ASO-NC，在轉(zhuǎn)染后24h，48h和72h檢測舌鱗癌細(xì)胞的生長活性。

2.7封閉miR-23a表達(dá)后，舌鱗癌細(xì)胞的凋亡明顯增強(qiáng):我們應(yīng)用紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(濃度為0.1ppc)，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h，將細(xì)胞轉(zhuǎn)接種至14孔板中，加入0.1ppc紫杉醇，藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用1h后，通過TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測IRF1對舌鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。我們封閉細(xì)胞內(nèi)源性miR-23a后應(yīng)用TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測舌鱗癌細(xì)胞的凋亡活性。如圖8所示，與ASO-NC組相比，ASO-23a組的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。如圖8A所示，封閉miR-23a后，ASO-23a組比ASO-NC組舌鱗癌細(xì)胞Tca8113的凋亡細(xì)胞明顯增加，凋亡指數(shù)由1.2%增加到7.8%(圖8B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明封閉miR-23a與過表達(dá)IRF1所得的結(jié)果一致，都可以促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的凋亡。

圖8 封閉miR-23a后TUNEL的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在Tca8113細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ASO-23a和ASO-NC，在轉(zhuǎn)染后的24h應(yīng)用0.1ppc紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡1h。(A)用熒光顯微鏡拍照計數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)目。(B) 對視野內(nèi)的細(xì)胞計數(shù)并統(tǒng)計出凋亡指數(shù)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)IRF1在舌鱗癌的表達(dá)降低，并且IRF1可以抑制舌鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞生長活性并且增強(qiáng)其細(xì)胞凋亡。我們通過TargetScan預(yù)測并經(jīng)熒光報告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IRF1上游受miR-23a調(diào)控，miR-23a通過靶定IRF1的3‘UTR降低了IRF1的表達(dá)，同時在舌鱗癌組織中miR-23a表達(dá)明顯高于對應(yīng)癌旁正常組織。

miRNA是非編碼RNA，長度為19-25個核苷酸。它是一種新型的基因表達(dá)調(diào)控分子，可以通過調(diào)控許多基因的表達(dá)來參與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。此前已有研究表明，部分miRNAs與OTSCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。microRNA-21和microRNA-375可以作為口腔鱗癌的生物標(biāo)志物。miR-21可降低OTSCC細(xì)胞系中HPGD的表達(dá)，熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-21直接靶向HPGD mRNA。也證實(shí)了PGE2介導(dǎo)的miR-21的上調(diào)，提示OTSCC細(xì)胞中存在參與miR-21、HPGD和PGE2的正前饋環(huán)，有助于腫瘤的發(fā)生。miR-498和miR-940影響OTSCC細(xì)胞的侵襲和遷移能力[10]。而miR-101參與了舌鱗癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程。hsa-miR-222通過直接順式調(diào)控機(jī)制(靶向MMP1 mRNA)和間接反式調(diào)控機(jī)制(靶向SOD2間接控制MMP1基因表達(dá))調(diào)控MMP1表達(dá)。hsa-miR-222在OTSCC侵襲中發(fā)揮重要作用，可能成為轉(zhuǎn)移性疾病風(fēng)險OTSCC患者新的治療靶點(diǎn)。

miR-23a直接和間接調(diào)控多種基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)腫瘤發(fā)生、腫瘤增殖、生存、細(xì)胞遷移和侵襲以及抗腫瘤治療的反應(yīng)，在癌癥診斷、預(yù)后和治療應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。例如，肺癌患者血清中循環(huán)miR-23a水平升高，miR-23a水平與促血管生成活性呈正相關(guān)。結(jié)腸癌患者血清標(biāo)本外泌體中miR-301a和miR-23a表達(dá)水平升高，可以作為結(jié)直腸癌早期檢測的非侵入性生物標(biāo)志物[11]。在前列腺癌中，青藤堿通過抑制miR-23a的表達(dá)水平，進(jìn)而前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲均受到抑制，同時細(xì)胞凋亡增加。然而，關(guān)于miR-23a在OTSCC中的表達(dá)及在OTSCC診斷中的意義的研究較少。

據(jù)報道，IRF1也可以通過結(jié)合其特定靶基因的啟動子來發(fā)揮其生物學(xué)功能。例如，IRF1可以結(jié)合ras相關(guān)基因RASSF5的啟動子，通過促進(jìn)RASSF5表達(dá)下調(diào)RAS-RAC1通路從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。在結(jié)腸癌中，IRF1表達(dá)顯著降低，而且體外試驗(yàn)表明IRF1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移并且可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期分布。在非小細(xì)胞肺癌中IRF1發(fā)揮潛在的抑癌作用，表皮生長因子和缺氧同時抑制IRF1的表達(dá)，且與其不良預(yù)后相關(guān)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)12份OTSCC標(biāo)本中，有11份標(biāo)本的IRF1水平較正常對照顯著降低(P<0.001)。體外試驗(yàn)表明，在OTSCC細(xì)胞中過表達(dá)IRF1后，細(xì)胞生長活性顯著降低，且細(xì)胞凋亡率增加。這些結(jié)果表明IRF1在OTSCC進(jìn)程中起到抑制作用，這與IRF1在胰腺癌，乳腺癌，胃癌和前列腺癌中的表達(dá)模式一致[12,13]。

封閉miR-23a后，舌鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡表型與過表達(dá)IRF1后表型改變一致。我們通過轉(zhuǎn)染miR-23a的反義寡核苷酸序列，封閉了舌鱗癌細(xì)胞中異常高表達(dá)的miR-23a，通過MTT實(shí)驗(yàn)與TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖與凋亡的改變，與過表達(dá)IRF1所得的表型改變一致。由于封閉了高表達(dá)的miR-23a，解除了對IRF1的抑制作用，相當(dāng)于過表達(dá)了IRF1，故二者的細(xì)胞表型變化一致。

綜上，本研究表明IRF1在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起到抑癌基因的作用。IRF1上游受到miR-23a的調(diào)控，在OTSCC組織中miR-23a表達(dá)明顯升高，下調(diào)了IRF1的表達(dá)水平，從而促進(jìn)了OTSCC細(xì)胞的增殖，抑制了細(xì)胞凋亡。